Приготовить мазок из исследуемого материала

1.чистка стекла

2.нанесение материала

3.размазывание материала на предметном стекле(мазок)

4.высушивание

5.фиксация

6.окрашивание

7.микроскопирование.

Высушивание. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращенным кверху, подержать в струе теплого воздуха, высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.
Фиксация. Используют физический и химический методы фиксаций. Физический - фиксация мазка над пламенем горелки или спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх. Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок так как при перегревании могут произойти необратимые изменения в клетке. Химический метод фиксации - более мягкий по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (этанол + эфир 1:1), метанол, фйрмалин. После фиксации мазок можно окрашивать.
Окраска мазка. На мазок нанести несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт краской. Оставить краску на определенное время. Промыть препарат водой, просушить фильтровальной бумагой.
Рассматривать препарат с использованием иммерсионной системы. Каплю иммерсионного масла можно наносить только на сухой мазок.
Отношение микроорганизмов к красящим веществам называется тинкториальным свойством. Наибольшее применение имеют основные краски: метиленовый синий, основной фуксин, генцианвиолет, кристаллический фиолетовый и другие.
Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение, так как дает возможность установить морфологические и тинкториальные особенности микроба. В некоторых случаях этого достаточно для постановки микробиологического диагноза.
Окраска микроорганизмов представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителем и окрашиваемым объектом и рН среды, в которой они находятся.
Различают простые и сложные методы окраски
К простым относятся методы с использованием одного вида красителя, к сложным - нескольких красителей.
Простые методы окраски: метиленовым синим - окраска в течение 3-5 мин;
генцнанвиолетом - окраска в течение 1 -2 мин;
фуксином водным - окраска в течение 1-2 мин.
Простыми методами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения.
Сложные методы окраски используют для дифференциации микробов по морфологическим и тинкториальным свойствам.

 

Работа с микроскопом

1. Микроскоп поставьте штативом к себе на расстоянии 5-10 см от края стола. Приведите микроскоп в рабочее положение, наклонив верхнюю часть штатива на 45 градусов. В отверстие предметного столика при помощи зеркала направьте свет.

2. Приготовленный препарат поместите на предметный столик и закрепите предметное стекло зажимами.

3. Пользуясь винтом, плавно опустите тубус так, чтобы нижний край объектива оказался на расстоянии 1-2 мм от препарата.

4. В окуляр смотрите одним глазом, не закрывая и не зажмуривая другой. Глядя в окуляр, при помощи винтов медленно поднимайте тубус, пока не появится чёткое изображение объекта исследования.

5. После работы микроскоп приведите в нерабочее положение и уберите в футляр.

Микроскоп - хрупкий и дорогой прибор: работать с ним надо аккуратно, строго следуя правилам.

 

Механизм окраски по ГРАМу

1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1-2 мин

2. Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин

3. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15-20 мин в зависимости от толщины мазка

4. Спирт смыть дистиллированной водой

5. Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2-3 мин

6. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией

7. Микроскопия с иммерсией.

Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр-) бактерии окрашиваются в красный цвет.

4.Принцип работы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии
При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопиитёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objectivelens).

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать «прямое поле»: необходимо провести фурье-преобразование полученного изображения и удалить из полученной суммы компоненту, соответствующую «опорной» волне. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется «опорная» световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

В микроскопах использование метода тёмного поля может быть предусмотрено конструкцией^[2] или реализуется установкой дополнительных узлов, таких, как конденсор темного поля ОИ-13.

Микроскопировани е -способ исследования микрообъектов.

· Для изучения неокрашенных объектов используется фазово-контрастное устройство, с помощью которого можно получить четкое контрастное изображение прозрачных, не имеющих окраски микроорганизмов.

 

Для получения фазовоконтрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути. Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.

 

Изображение клетки в фазово-контрастном микроскопе

Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки (англ.)русск., расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.

Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки, из-за которого та может погибнуть.