Определение чувствительности микрофлоры к макролидам

В последние годы значение определения чувствительности микроорганизмов к макролидным антибиотикам in vitro возрастает в связи с появлением и распространением резистентности у ранее чувствительных к ним бактерий, а также в связи с необходимостью знания эпидемиологической ситуации для эмпирической антимикробной терапии при респираторных и других инфекциях.

Выбор видов микроорганизмов для определения чувствительности к макролидам определяется спектром активности этих препаратов. В обычной лабораторной практике исследуют чувствительность к макролидам у S.pyogenes, пневмококков, золотистых и коагулазонегативных стафилококков, гемофильной палочки (азитромицин) [12]. В некоторых специализированных лабораториях определяют чувствительность кампилобактеров, Н.pylori, "атипичных" возбудителей (хламидий, микоплазм, уреаплазм, легионелл), M.avium и анаэробов.

Современные стандартизированные методы определения чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных разведений (в агаре и бульоне, метод микроразведений) и диффузионные (диско-диффузионный метод и метод Е-тестов) [13,14]. Методы серийных разведении и Е-тесты позволяют получить количественную характеристику чувствительности микроорганизмов - МПК антибиотика в отношении данного возбудителя, а диско-диффузионный метод является полуколичественным и позволяет подразделить все штаммы на три категории - чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные, но при регистрации и анализе диаметра зон он в ряде случаев приближается к количественным методам.

Методы разведений являются достаточно сложными, трудоемкими и используются в основном при исследовании новых антибиотиков, при проведении научных проектов, в рамках эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микроорганизмов.

Диско-диффузионный метод представляет наиболее простой, удобный и широко используемый метод при рутинном микробиологическом исследовании чувствительности к антибиотикам обычных быстрорастущих и некоторых микроорганизмов со сложными питательными потребностями (стрептококки, пневмококки, гемофилы, гонококки) [15]. Этот метод основан на регистрации диаметра зоны подавления роста микроорганизма вокруг бумажного диска с антибиотиком. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста пропорциональна величине МПК, поэтому диско-диффузионный метод позволяет косвенно судить о величине МПК. Оценка результатов проводится с использованием критериев интерпретации, разработанных на основе корреляции значений диаметров зон подавления роста и МПК антибиотика.

Однако необходимо помнить, что на результаты определения чувствительности могут влиять многие факторы, такие как состав, рН, толщина и равномерность слоя питательной среды, плотность микробной взвеси (инокулюм), скорость роста микроорганизма и возраст культуры, условия инкубации (температура, атмосфера), содержание антибиотика в диске и скорость диффузии его в агар и т. д. [16]. Поэтому эта методика требует строгой стандартизации: использования строго определенного агара, соблюдения правил приготовления инокулюма, условий инокуляции и инкубации чашек, правильного и регулярного проведения процедур по контролю качества.

Необходимо отметить, что макролиды являются одной из тех групп антимикробных препаратов, которые наиболее "требовательны" к соблюдению условий определения чувствительности для получения корректных результатов, причем основными факторами, влияющими на результаты, являются рН питательной среды и атмосфера инкубации (повышенное содержание CO₂), что в конечном итоге также приводит к изменению рН агара.

Известно, что макролидные антибиотики наиболее активны при рН>7,5 и наименее - при рH<7,0. Для объяснения этого эффекта Fiese и Steffen [17] в 1990 году была предложена следующая гипотеза. У основных радикалов молекул макролидных антибиотиков, в частности эритромицина и азитромицина, рК составляют 8,4-8,8. Поэтому при рН равном 8,0 молекулы макролидов в неионизированном состоянии легче проникают через цитоплазматическую мембрану микробной клетки и связываются с рибосомами. Поскольку значение рН внутри клетки более нейтрально (рН 7,2), чем вне ее (рН 8,0), внутри клетки происходит большая ионизация молекул макролидов, что приводит к накоплению антибиотиков внутри клетки. Если рН питательной среды равно 6,0, то молекулы макролидов полностью ионизируются и практически не способны проникать через цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки. Так как молекула азитромицина содержит два основных радикала, а эритромицина только один, то азитромицин более чувствителен к изменениям рН среды. В других исследованиях было показано, что наиболее чувствительны к изменениям рН азитромицин и диритромицин (их МПК при рН 7,2 ниже на 3-4 двойных серийных разведения, чем при рН 8,0), менее чувствительны - эритромицин, рокситромицин, кларитромицин, флуритромицин и спирамицин (различие в МПК - 1-2 разведения) и наиболее стабильны - миокамицин, джосамицин и рокитамицин (МПК не изменялись или не отличались более чем на 1 разведение при различных значениях рН) [18,19].

Влияние повышенного содержания CO₂ в атмосфере инкубации на активность макролидных антибиотиков in vitro показано многими авторами. Доказано, что присутствие 5% CO₂ приводит к очень быстрому - в течение 1 часа - снижению рН питательной среды с 7,3 до 7,1, что существенно уменьшает активность макролидов [8].

При определении чувствительности к макролидам у капнофильных бактерий (пневмококки, другие стрептококки, гемофильная палочка) возникает дилемма, так как для хорошего роста эти микроорганизмы нуждаются в присутствии в атмосфере 5% СО₂. Поэтому определение чувствительности диско-диффузионным методом, методом разведения в агаре и Е-тестами требует инкубации в атмосфере с повышенным содержанием СО₂. Только при использовании метода макро- и микроразведений в жидкой питательной среде инкубацию проводят в обычной атмосфере. Вследствие этого отмечается повышение МПК макролидов на 1-8 разведений при использовании метода Е-тестов или разведения в агаре по сравнению с методом микроразведений, что показано при тестировании пневмококков к эритромицину, азитромицину и кларитромицину [8,10,20], пиогенных стрептококков к азитромицину [10], гемофильной палочки к эритромицину, кларитромицину, диритромицину и азитромицину [8,21], что может привести к завышению уровня резистентности к макролидам.

Аналогичный эффект сниженного рН и инкубации в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ был показан при определении чувствительности штаммов стафилококков и грамотрицательных бактерий к эритромицину и азитромицину [16]. Однако эти данные не имеют большого практического значения, так как согласно стандартным процедурам при тестировании стафилококков инкубацию следует проводить в обычной атмосфере, а определение чувствительности грамотрицательных бактерий (кроме гемофильной палочки) к макролидам вообще не проводится.

Гемофильная палочка (H.influenzae) представляет собой еще одну проблему при определении чувствительности к антибиотикам вообще и макролидам в частности. При тестировании гемофильной палочки необходимо использовать специальный агар НТМ. При использовании других питательных сред (например, шоколадного агара) результаты определения чувствительности могут значительно отличаться от полученных на НТМ. Кроме того, для хорошего роста H.influenzae также требуется повышенное содержание СО₂. Однако даже при самом строгом соблюдении рекомендаций NCCLS при тестировании H.influenzae к макролидам диско-диффузионным методом выявляется более 50% ошибок в интерпретации результатов. Поэтому рекомендуется использовать Е-тесты как наиболее достоверный и простой количественный метод [22].

Для стандартизации процедуры определения чувствительности разработаны национальные и интернациональные стандарты по методике выполнения тестирования и соответствующие критерии интерпретации результатов. Такие стандарты существуют в Германии (DIN), Великобритании (BSAC), Франции, скандинавских странах, США (NCCLS).

В России таким стандартом продолжают служить Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков Минздрава СССР, опубликованные в 1983 году [23]. Однако эти стандарты не описывают методики определения чувствительности "привередливых" микроорганизмов, таких как пневмококки, стрептококки, гемофильная палочка, и не содержат критериев интерпретации результатов определения чувствительности к новым макролидным антибиотикам, а только к эритромицину и олеандомицину.

Наиболее полно разработанными и широко используемыми в международной практике являются стандарты Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам - NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), США, которые регулярно пересматриваются и по мере необходимости корректируются.

В международной практике основной питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам является среда Мюллер-Хинтон. Проблемы, возникающие при тестировании микроорганизмов с особыми требованиями к среде, могут быть решены путем внесения в агар различных добавок. Для тестирования пневмококков и стрептококков агар Мюллер-Хинтон обогащают 5% дефибринированной бараньей крови, для тестирования гемофильной палочки в агар Мюллер-Хинтон вносят 5 мг/мл дрожжевого экстракта и факторы Х (гематин) и V (НАД) по 15 мкг/мл. Эта пропись получила название Haemophilus Test Medium (англ.) - НТМ, - и является единственной питательной средой, рекомендованной в международной практике для определения чувствительности H.influenzae к антибиотикам [12].

В практике бактериологических лабораторий России для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используется питательная среда АГВ. Для тестирования стрептококков и пневмококков, согласно отечественным правилам рекомендуется использовать среду АГВ, обогащенную 5% дефибринированной или гемолизированной крови. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности стрептококков и пневмококков на среде АГВ с кровью не разработаны. Рекомендаций по тестированию гемофильной палочки эти указания вообще не содержат. Поэтому в практике отечественных лабораторий для определения чувствительности гемофильной палочки используют самые разнообразные варианты сред (шоколадный агар, шоколадный агар с Изовиталексом и др.), что приводит к получению недостоверных и не сравнимых между собой результатов.

Нами было проведено исследование возможности использования среды АГВ вместо агара Мюллер-Хинтон для определения чувствительности микроорганизмов к 16-членному макролидному антибиотику мидекамицину. Тестирование было проведено в соответствии с методикой NCCLS. Было обнаружено, что при тестировании штаммов стафилококков, b-гемолитических стрептококков и пневмококков (использовали среду АГВ с 5% дефибринированной человеческой крови) диаметры зон подавления роста вокруг дисков с мидекамицином на среде АГВ не отличаются от полученных на агаре Мюллер-Хинтон. При тестировании штаммов гемофильной палочки на средах, приготовленных на основе АГВ (шоколадный агар, агар с дрожжевым экстрактом и факторами Х и V), диаметры зон значительно отличались от полученных на НТМ.

Таким образом, необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение возможности использования отечественной среды АГВ вместо агара Мюллер-Хинтон для определения чувствительности различных бактерий к современным макролидам, разработку критериев интерпретации результатов, а также стандартных методик тестирования микроорганизмов со сложными питательными потребностями.

В большинстве случаев отмечается полная перекрестная резистентность к макролидным антибиотикам. Поэтому на практике обычно определяют чувствительность грамположительных микроорганизмов (стрептококков и стафилококков) только к одному антибиотику из группы макролидов - обычно к эритромицину. Однако в отношении штаммов стафилококков, обладающих индуцибельной резистентностью к эритромицину, связанной с метилированием 23S фрагмента 50S-субъединицы рибосом, 16-членные макролиды (джосамицин, спирамицин, мидекамицин) проявляют активность in vitro и считаются возможной альтернативой в клинической практике. Для определения типа резистентности к макролидам у стафилококков (индуцибельный или конститутивный) используют диско-диффузионный тест для выявления антагонизма между линкомицином и эритромицином in vitro - специфического признака индуцибельного типа резистентности к макролидам, линкосамидам и стрептограминам (MLS_B-тип резистентности). В этом случае штамм считается резистентным к 14- и 15-членным макролидам, но чувствительным к 16-членным макролидам и линкосамидам. В случае конститутивного типа MLS_B резистентности штаммы стафилококков резистентны ко всем без исключения макролидам и линкосамидам.

В приложении I-II приведена суммарная информация по определению чувствительности к макролидным антибиотикам диско-диффузионным методом. Приведенная информация в основном соответствует стандартам NCCLS 1997 года, часть данных приведена из Доклада комитета по антибиотикам Французского общества микробиологов (SFM) в 1996 году.