Глава 2. Экспериментальная часть

Руководитель практики

д.г.-м.н., профессор ______________ Голованова О.А

подпись, дата

Зав. кафедрой

д.т.н., профессор ______________ Борбат В.Ф.

подпись, дата

 

 

Омск 2017 г.

Оглавление

Введение. 3

Глава 1. Литературный обзор. 4

1.1. Десорбция. 4

1.2. Механизм адсорбции-десорбции СМД моделирования. 5

Глава 2. Экспериментальная часть. 8

2.1. Методика проведения адсорбционного эксперимента. 8

2.2. Методика фотометрического определения аминокислот. 8

2.3. Методика рентгенофазового анализа. 9

2.4. Методика проведения десорбционного эксперимента. 10

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 11

3.1. Результаты исследования методом РФА.. 11

3.2. Адсорбционный эксперимент пролина на гидроксилапатите. 16

3.2.1. Изучение влияния варьирования концентрации пролина на адсорбцию.. 16

3.2.2. Изучение влияния рН раствора на значение максимальной адсорбции. 18

3.3. Расчет значений свободной энергии Гиббса при адсорбции аминокислот на поверхности гидроксилапатита. 19

3.4. Десорбционный эксперимент аминокислот на гидроксилапатите и брушите. 20

Выводы.. 22

Список используемой литературы.. 23

 

 

Введение

Взаимодействие органической и минеральной составляющих имеет важное значение в таких процессах биогенной кристаллизации, как формирование костного матрикса млекопитающих, а также зарождение и рост патогенных образований.

Фосфаты кальция входят в состав физиогенных и патогенных минеральных образований. Физиогенные образования входят в состав тех или иных органов и выполняют различные функции, они генетически обусловлены, их место в организме строго определено. Патогенные минеральные образования возникают в результате нарушения функционирования всего организма или его отдельного органа.

Существует ряд предположений, согласно которым в основе процессов минерализации лежит адсорбционное взаимодействие свободных аминокислот и связанных в белковые молекулы с неорганическими компонентами биожидкостей. Механизм их взаимодействия до конца не изучен.

В связи с этим актуальны исследования, направленные на изучение закономерностей адсорбции аминокислот на неорганической составляющей большинства патогенных новообразований – фосфатах кальция. Таким образом, актуальным является изучение механизмов взаимодействия аминокислот с фосфатом кальция.

Целью данной работы является изучение влияния рН раствора на процесс адсорбции аминокислот на гидроксилапатите.

Для достижения выбранной цели были поставлены следующие задачи:

1. Постановка адсорбционного эксперимента;

2. Изучение адсорбции аминокислот на гидроксилапатите при варьировании параметров исходного раствора.

3. Изучение десорбции аминокислот на гидроксилапатите при варьировании параметров исходного раствора.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Десорбция

Десорбция – это обратная адсорбция; происходит, когда молекулы, ранее привязанные к поверхности, отсоединяются и возвращаются в объемную фазу. Для прохождения десорбции, все контакты между белком и поверхностью должны быть одновременно сломаны (Рис. 1). Хотя хорошо характеризуется для малых молекул, таких как газы, десорбция белков медленно или отсутствует. Если в межфазную среду не вносятся кардинальные изменения, такие как повышение ионной силы, снижение рН и использование диссоциирующих агентов или моющих средств, адсорбция белка в значительной степени необратима из-за требования одновременной диссоциации всех взаимодействий между молекулой и поверхностью. Трудность или невозможность одновременного разрушения всех контактов еще больше возрастает за счет больших белков, которые могут формировать большее количество связей с поверхностью. Рассмотрим пример адсорбции фибриногена. Для молекулы фибриногена, чтобы десорбировать, все 703 контакта с поверхностью должны быть сломаны в одно и то же время. Однако адсорбированные белки могут быть заменены молекулами того же или другого типа белка [1].

Рис.1. Десорбция белка требует одновременного разрыва всех связей с поверхностью.

Адсорбциия/десорбция белков, таких как бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве кислого белка и хлорид лизоцима (ЛИЗ) в качестве основного белка, была исследована с помощью игольчатого гидроксилапатита. По результатам исследования было обнаружено, что ЛИЗ адсорбируется сильнее, чем БСА [2].

1.2. Механизм адсорбции-десорбции СМД моделирования.

На основе равновесной структуры проведено СМД-моделирование в течение 1 нс. Виртуальная пружина между фиктивными атомами и атомами СМД имела упругость пружины 20 ккал/(моль*Ų) и постоянную скорость 0.042 Å*пс^-1. Весь анализ ниже основан на этом моделировании. Снимки этой системы в течение всей 1 нс СМД-моделирования представлены на рис. 2. Анализируя полученные траектории, можно наблюдать, как процесс от адсорбции к десорбции идет шаг за шагом. На начальном этапе (0 пс), нет адсорбированных остатков на поверхности ГА (Рис. 2 а), поэтому при применении внешней силы, белок начал выходить на поверхность ГА сразу (Рис. 2 b). Это неадсорбционный период. Хотя некоторые остатки были ближе к поверхности ГА (001), они не были адсорбированы. Исследователи определили эти остатки как неадсорбционные. В процессе моделирования остатки БМП-2 продолжали вибрировать, чтобы достичь наилучшего взаимодействия с ГА под воздействием внешней силы и тысяч окружающих молекул воды. Медленно, некоторые остатки корпуса БМП-2 были адсорбированы на ГА (001) поверхности (Рис. 2 с). Учитывая, что эти первые адсорбированные остатки находятся в средней части БМП-2 (в равновесном положении) и что уже имеются остатки, которые тесно взаимодействовуют с поверхностью ГА (001) в правой части БМП-2, они считали, что эти адсорбированные остатки играли роль опоры в рычаге. Таким образом, они были названы в качестве опоры - адсорбции остатков и промежутка времени называется адсорбцией период опоры. Под воздействием внешней силы, которая равномерно наносилась на структуру атомов БМП-2, начала появляться левая часть БМП-2. В соответствии с принципом рычага, правая часть была гораздо ближе к поверхности ГАП (Рис. 2, с–e). Это изменение опять-таки способствовало взаимодействию адсорбции остатков и ГА. Это ключ-адсорбционный период. Таким образом, адсорбция этих остатков была основной силой взаимодействия и они определили их как ключ-адсорбцию остатков (Рис. 2, d–f). На 600 пс взаимодействие между остаточными частями белка и поверхностью ГА было нарушено под действием внешней силы, и БМП-2 начал десорбироваться с поверхности кристаллического ГА. С тех пор никакого другого явления адсорбции не произошло. В 700 пс, процесс десорбции был полностью завершен, и ориентация БМП-2 больше не менялась (Рис. 2 f). Она сохранила перпендикулярную ориентацию по отношению к ГА (001) поверхности и отошла от ГА до конца моделирования СМД (1000 пс). Поэтому, кажется, что правая часть будет наиболее подвержена адсорбции на поверхности ГА (001) [3].

Кроме того, стоит отметить, что позиции опоры-адсорбции и адсорбции функциональных групп на различные части БМП-2, отличаются от теоретических и экспериментальных результатов для других белков [4,5]. Это свидетельствует о том, что тип взаимодействия различается по различным структурным характеристикам белков, как свидетельствуют экспериментальные результаты Валлворка и др. [6,7].

Как показано на рисунке. 2, БМП-2 фактически взаимодействуюет с конца, а не со стороны. Детали SMD показывают, что именно принцип рычага приводит к драматическому явлению вращения. Как уже упоминалось выше, взаимодействия между левой частью БМП-2 и ГА нет, но есть для средней и правой части. Видимо, сила, применяемая на БМП-2, не сбалансирована. Согласно принципу рычага, БМП-2 будет вращаться и притягательная сила на средней части БМП-2 выступает в качестве опоры. Наряду с вращением, ключ-адсорбция группы в правой части находится гораздо ближе к поверхности ГА. Соответственно, сильное взаимодействие ускоряет процесс вращения до полного завершения БМП-2 [3].

Рис. 2. Cнимки 1 нс СМД-моделирования ключевые остатки или атомы, отмеченные (все молекулы воды опущены для ясности, и О, N и H атомы отмечены легко затемненные, затененные и открытые, соответственно). (а) 0 пс; (б) 100 пс; (в) 200 пс; (д) 400 пс; (е) 600 пс; и (F) 700 пс. Отмеченные остатки (слева направо): (а,b) Lys15, Pro18, His39, Tyr20, и Pro36; (с) Ser24, Asn29, и Asp30; и (d–f) Glu96, Asn95, и Glu94.

В своем исследовании Каджима и Ватанабе провели адсорбцию и десорбцию цитохрома С и инсулина на поверхности гидроксилапатита. Было установлено, что катионический цитохром С и анионный инсулин при физиологическом рН поглощались и десорбировались в разных манерах. Потому что заряд инсулина был изменен с уменьшением рН, это заметно повлияло на поведение адсорбции и десорбции. Поведение адсорбции и десорбции может быть очень сложным, потому что большие молекулы белка связываются с ГА в нескольких точках. Поэтому регулирование контролируемой десорбции белка еще предстоит исследовать[8].

 

Выводы

1. Методом РФА установлены фазы твердых осадков до и после процесса адсорбции, они представлены фазой гидроксилапатита. Определены их параметры кристаллических решеток и рассчитаны размеры кристаллитов.

2. Исследована адсорбция пролина на поверхности гидроксилапатита и показано, что максимальная адсорбция происходит при рН = 6,00 ± 0,05. Установлено, что адсорбция пролина описывается моделью Лэнгмюра.

3. Рассчитаны значения свободных энергий Гиббса для аминокислот при адсорбции на гидроксилапатите.

4. Проведена десорбция аминокислот с поверхности гидроксилапатита, установлено, что десорбция достигает предела при рН близком к изоэлектрической точке аминокислоты.

5. Проведена десорбция с поверхности брушита, установлено, что десорбция аминокислот достигает предела в рН раствора, находящихся ближе к изоэлектрической точке.

 

Список используемой литературы

1. Kay C. Dee, David A. Puleo, Rena Bizios. An Introduction to Tissue-Biomaterial Interactions. ISBN: 978-0-471-25394-5, Wiley 2002. Р. 37-52.

2. O. Takagi, N. Kuramoto, M. Ozawa, S. Suzuki, Adsorption/desorption of acidic and basic proteins on needle-like hydroxyapatite filter prepared by slip casting, Ceram. Int. 30. 2004. P. 139–143.

3. Xiuli Dong, Qi Wang, Tao Wu, and Haihua Pan. Understanding Adsorption-Desorption Dynamics of BMP-2 on Hydroxyapatite (001) Surface. Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou, China. Biophysical Journal. V. 93 August 2007. Р. 750–759.

4. Chen, X., Q. Wang, J. Shen, H. Pan, and T. Wu. 2007. Adsorption of LRAP on hydroxyapatite (001) surface through –COO claws. J. Phys. Chem. C. 111. Р. 1284–1290.

5. Shaw, W. J., J. R. Long, J. L. Dindot, A. A. Campbell, P. S. Stayton, and G. P. Drobny. 2000. Determination of statherin N-terminal peptide conformation on hydroxyapatite crystals. J. Am. Chem. Soc. 122. Р. 1709– 1716.

6. Wallwork, M. L., J. Kirkham, J. Zhang, S. J. Brookes, R. C. Shore, S. R. Wood, O. Ryu, C. Robinson, and D. A. Smith. 2001. Binding of matrix proteins to developing enamel crystals: an atomic force microscopy study. Langmuir. 17. Р. 2508–2513.

7. Huimin Wang; Guihua Nie; Kui Fu. Cellular Automata Model of Protein Adsorption on the Surface of Bioceramics. 2008. P. 417-420. (DOI: 10.1109/ICNC.2008.611)

8. Chie Kojima,Kenji Watanabe. Adsorption and Desorption of Bioactive Proteins on Hydroxyapatite for Protein Delivery Systems. J Drug Deliv. 2012. P. 932461. (doi: 10.1155/2012/932461)

9. Солоненко А.П. Исследование влияния условий кристаллзации на физико-химические свойства химически модифицированных фосфатов кальция. Дис. кандидата хим. наук. Омск., 2014. 171 с.

 

 

Руководитель практики

д.г.-м.н., профессор ______________ Голованова О.А

подпись, дата

Зав. кафедрой

д.т.н., профессор ______________ Борбат В.Ф.

подпись, дата

 

 

Омск 2017 г.

Оглавление

Введение. 3

Глава 1. Литературный обзор. 4

1.1. Десорбция. 4

1.2. Механизм адсорбции-десорбции СМД моделирования. 5

Глава 2. Экспериментальная часть. 8

2.1. Методика проведения адсорбционного эксперимента. 8

2.2. Методика фотометрического определения аминокислот. 8

2.3. Методика рентгенофазового анализа. 9

2.4. Методика проведения десорбционного эксперимента. 10

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 11

3.1. Результаты исследования методом РФА.. 11

3.2. Адсорбционный эксперимент пролина на гидроксилапатите. 16

3.2.1. Изучение влияния варьирования концентрации пролина на адсорбцию.. 16

3.2.2. Изучение влияния рН раствора на значение максимальной адсорбции. 18

3.3. Расчет значений свободной энергии Гиббса при адсорбции аминокислот на поверхности гидроксилапатита. 19

3.4. Десорбционный эксперимент аминокислот на гидроксилапатите и брушите. 20

Выводы.. 22

Список используемой литературы.. 23

 

 

Введение

Взаимодействие органической и минеральной составляющих имеет важное значение в таких процессах биогенной кристаллизации, как формирование костного матрикса млекопитающих, а также зарождение и рост патогенных образований.

Фосфаты кальция входят в состав физиогенных и патогенных минеральных образований. Физиогенные образования входят в состав тех или иных органов и выполняют различные функции, они генетически обусловлены, их место в организме строго определено. Патогенные минеральные образования возникают в результате нарушения функционирования всего организма или его отдельного органа.

Существует ряд предположений, согласно которым в основе процессов минерализации лежит адсорбционное взаимодействие свободных аминокислот и связанных в белковые молекулы с неорганическими компонентами биожидкостей. Механизм их взаимодействия до конца не изучен.

В связи с этим актуальны исследования, направленные на изучение закономерностей адсорбции аминокислот на неорганической составляющей большинства патогенных новообразований – фосфатах кальция. Таким образом, актуальным является изучение механизмов взаимодействия аминокислот с фосфатом кальция.

Целью данной работы является изучение влияния рН раствора на процесс адсорбции аминокислот на гидроксилапатите.

Для достижения выбранной цели были поставлены следующие задачи:

1. Постановка адсорбционного эксперимента;

2. Изучение адсорбции аминокислот на гидроксилапатите при варьировании параметров исходного раствора.

3. Изучение десорбции аминокислот на гидроксилапатите при варьировании параметров исходного раствора.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Десорбция

Десорбция – это обратная адсорбция; происходит, когда молекулы, ранее привязанные к поверхности, отсоединяются и возвращаются в объемную фазу. Для прохождения десорбции, все контакты между белком и поверхностью должны быть одновременно сломаны (Рис. 1). Хотя хорошо характеризуется для малых молекул, таких как газы, десорбция белков медленно или отсутствует. Если в межфазную среду не вносятся кардинальные изменения, такие как повышение ионной силы, снижение рН и использование диссоциирующих агентов или моющих средств, адсорбция белка в значительной степени необратима из-за требования одновременной диссоциации всех взаимодействий между молекулой и поверхностью. Трудность или невозможность одновременного разрушения всех контактов еще больше возрастает за счет больших белков, которые могут формировать большее количество связей с поверхностью. Рассмотрим пример адсорбции фибриногена. Для молекулы фибриногена, чтобы десорбировать, все 703 контакта с поверхностью должны быть сломаны в одно и то же время. Однако адсорбированные белки могут быть заменены молекулами того же или другого типа белка [1].

Рис.1. Десорбция белка требует одновременного разрыва всех связей с поверхностью.

Адсорбциия/десорбция белков, таких как бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве кислого белка и хлорид лизоцима (ЛИЗ) в качестве основного белка, была исследована с помощью игольчатого гидроксилапатита. По результатам исследования было обнаружено, что ЛИЗ адсорбируется сильнее, чем БСА [2].

1.2. Механизм адсорбции-десорбции СМД моделирования.

На основе равновесной структуры проведено СМД-моделирование в течение 1 нс. Виртуальная пружина между фиктивными атомами и атомами СМД имела упругость пружины 20 ккал/(моль*Ų) и постоянную скорость 0.042 Å*пс^-1. Весь анализ ниже основан на этом моделировании. Снимки этой системы в течение всей 1 нс СМД-моделирования представлены на рис. 2. Анализируя полученные траектории, можно наблюдать, как процесс от адсорбции к десорбции идет шаг за шагом. На начальном этапе (0 пс), нет адсорбированных остатков на поверхности ГА (Рис. 2 а), поэтому при применении внешней силы, белок начал выходить на поверхность ГА сразу (Рис. 2 b). Это неадсорбционный период. Хотя некоторые остатки были ближе к поверхности ГА (001), они не были адсорбированы. Исследователи определили эти остатки как неадсорбционные. В процессе моделирования остатки БМП-2 продолжали вибрировать, чтобы достичь наилучшего взаимодействия с ГА под воздействием внешней силы и тысяч окружающих молекул воды. Медленно, некоторые остатки корпуса БМП-2 были адсорбированы на ГА (001) поверхности (Рис. 2 с). Учитывая, что эти первые адсорбированные остатки находятся в средней части БМП-2 (в равновесном положении) и что уже имеются остатки, которые тесно взаимодействовуют с поверхностью ГА (001) в правой части БМП-2, они считали, что эти адсорбированные остатки играли роль опоры в рычаге. Таким образом, они были названы в качестве опоры - адсорбции остатков и промежутка времени называется адсорбцией период опоры. Под воздействием внешней силы, которая равномерно наносилась на структуру атомов БМП-2, начала появляться левая часть БМП-2. В соответствии с принципом рычага, правая часть была гораздо ближе к поверхности ГАП (Рис. 2, с–e). Это изменение опять-таки способствовало взаимодействию адсорбции остатков и ГА. Это ключ-адсорбционный период. Таким образом, адсорбция этих остатков была основной силой взаимодействия и они определили их как ключ-адсорбцию остатков (Рис. 2, d–f). На 600 пс взаимодействие между остаточными частями белка и поверхностью ГА было нарушено под действием внешней силы, и БМП-2 начал десорбироваться с поверхности кристаллического ГА. С тех пор никакого другого явления адсорбции не произошло. В 700 пс, процесс десорбции был полностью завершен, и ориентация БМП-2 больше не менялась (Рис. 2 f). Она сохранила перпендикулярную ориентацию по отношению к ГА (001) поверхности и отошла от ГА до конца моделирования СМД (1000 пс). Поэтому, кажется, что правая часть будет наиболее подвержена адсорбции на поверхности ГА (001) [3].

Кроме того, стоит отметить, что позиции опоры-адсорбции и адсорбции функциональных групп на различные части БМП-2, отличаются от теоретических и экспериментальных результатов для других белков [4,5]. Это свидетельствует о том, что тип взаимодействия различается по различным структурным характеристикам белков, как свидетельствуют экспериментальные результаты Валлворка и др. [6,7].

Как показано на рисунке. 2, БМП-2 фактически взаимодействуюет с конца, а не со стороны. Детали SMD показывают, что именно принцип рычага приводит к драматическому явлению вращения. Как уже упоминалось выше, взаимодействия между левой частью БМП-2 и ГА нет, но есть для средней и правой части. Видимо, сила, применяемая на БМП-2, не сбалансирована. Согласно принципу рычага, БМП-2 будет вращаться и притягательная сила на средней части БМП-2 выступает в качестве опоры. Наряду с вращением, ключ-адсорбция группы в правой части находится гораздо ближе к поверхности ГА. Соответственно, сильное взаимодействие ускоряет процесс вращения до полного завершения БМП-2 [3].

Рис. 2. Cнимки 1 нс СМД-моделирования ключевые остатки или атомы, отмеченные (все молекулы воды опущены для ясности, и О, N и H атомы отмечены легко затемненные, затененные и открытые, соответственно). (а) 0 пс; (б) 100 пс; (в) 200 пс; (д) 400 пс; (е) 600 пс; и (F) 700 пс. Отмеченные остатки (слева направо): (а,b) Lys15, Pro18, His39, Tyr20, и Pro36; (с) Ser24, Asn29, и Asp30; и (d–f) Glu96, Asn95, и Glu94.

В своем исследовании Каджима и Ватанабе провели адсорбцию и десорбцию цитохрома С и инсулина на поверхности гидроксилапатита. Было установлено, что катионический цитохром С и анионный инсулин при физиологическом рН поглощались и десорбировались в разных манерах. Потому что заряд инсулина был изменен с уменьшением рН, это заметно повлияло на поведение адсорбции и десорбции. Поведение адсорбции и десорбции может быть очень сложным, потому что большие молекулы белка связываются с ГА в нескольких точках. Поэтому регулирование контролируемой десорбции белка еще предстоит исследовать[8].

 

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Методика проведения адсорбционного эксперимента

Навеску гидроксилапатита массой 0.5 г помещают в колбу и заливают раствором аминокислоты. Варьируется концентрация аминокислоты: 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30 ммоль/л и варьируется рН 5,00-8,00 ± 0,05 (кроме 6,50) с шагом 0,50. Проводят встряхивание в течение 30 минут, после чего оставляют на 48 часов. По истечении указанного времени содержимое колб фильтруют и определяют содержание аминокислот в фильтрате методом перевода аминокислот в растворимые медные соли и их последующем фотометрическом определение, измеряют рН после адсорбции, определяют массы осадков.

Для определения уравнения описывающего адсорбцию, проведена обработка экспериментальных данных с позиции теории Лэнгмюра (1) и теории Фрейндлиха (2).

(1)

где Г_∞ - величина предельной адсорбции, моль/кг;

b - константа адсорбционного равновесия;

С – равновесная концентрация адсорбата, моль/л.

(2)

где а – коэффициент пропорциональности,

n – показатель степени, n<1.

2.2. Методика фотометрического определения аминокислот

Сущность метода:

Для определения концентрации аминокислот используется анализ, основанный на переводе аминокислот в растворимые медные соли и их последующем фотометрическом определении. Для измерений используется фотоэлектрокалориметр КФК-2. Рассеянный свет можно считать фиктивно поглощенным, и поэтому есть все основания принимать, что закономерности рассеяния света подчиняются уравнению Бугера-Ламберта-Бера.

Реактивы

1) 0,16 моль/л раствор сульфата меди;

2) Раствор фосфата натрия. Растворяют 64,5 г Na₂HPO₄∙12H₂O в 0,5л воды без углекислоты, и после добавления 7,2 г NaOH, доводят дистиллированной водой до 1,000 л;

3) Боратный буфер с рН=8,9. Готовят доведением 80,5 мл 0,05 М раствора тетрабората натрия (12,367 г Н₃ВО₃ в 100 мл 1 н NaOH) до 100 мл 0,1 н раствором НСl);

4) Взвесь фосфорнокислой меди (готовят перед употреблением из упомянутых выше трех растворов: сначала смешивают растворы 1 и 2 в соотношении 1:2, а затем добавляют 2 (1+2) объема буфера).

Проведение анализа:

Для определения концентрации аминокислот в исследуемых растворах, строят калибровочный график по серии растворов с концентрациями 0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010, 0.015, 0.020 моль/л, которые готовят разбавлением исходного раствора аминокислоты с концентрацией 0.020 моль/л. В мерные или конические колбы на 50.0 мл вносят пипеткой 5 мл раствора аминокислоты с определенной концентрацией, прибавляют 5 мл медной фосфорнокислой взвеси (реактив 4) и встряхивают в течение 20 мин. Содержимое колб фильтруют через складчатые фильтры. Фильтрат фотометрируют против холостого раствора на приборе КФК-2. Для сравнения служит контрольный раствор, который готовят аналогично, приливая вместо раствора аминокислоты 5 мл дистиллированной воды и 5 мл медной фосфорнокислой взвеси. Определение оптической плотности стандартных растворов проводятся в интервале длин волн, включающем величину 670 нм. Для измерений используются кюветы с толщиной светопоглощающего слоя 1 см. По полученным значениям оптической плотности для серии растворов строят калибровочный график.

2.3. Методика рентгенофазового анализа

Исследование методом рентгенофазового анализа было выполнено на порошковом рентгеновском дифрактометре D8 Advance (Bruker) в Cu-kα излучении (длина волны 0.15406 нм) с использованием позиционно-чувствительного детектора Lynxeye. Использованы следующие режимы измерения:

1. для фазового анализа:

шаг сканирования — 0.050, время накопления сигнала - 4 сек/точке, div.slit=0.3, напряжение и ток накала 40 kV и 40 mA, соответственно; область сканирования 2θ: 5-80о.

2. для уточнения параметров решетки и расчета размеров ОКР:

шаг сканирования — 0.020, время накопления сигнала - 2 сек/точке, div.slit=0.3, напряжение и ток накала 40 kV и 40 mA, соответственно; область сканирования 2θ: 15-65о; в образец добавлялся порошок кремния Si (SRM 640d) в качестве внутреннего стандарта.

Расшифровка полученных дифрактограмм проведена с использованием базы данных по порошковой дифракции ICDD PDF-2, 2006 года в программе EVA (Bruker).

Уточнение параметров решетки выполнено в программе TOPAS 4.2. (Bruker) по методу наименьших квадратов. Расчет размеров ОКР выполнен по методу фундаментальных параметров (FP) с учетом инструментальной погрешности, которая определялась по стандартному образцу Si (SRM 640d).

2.4. Методика проведения десорбционного эксперимента

Навеску фосфата кальция с адсорбированной аминокислотой массой 0.5 г помещают в колбу и заливают водным раствором. Варьируется рН 5,00-8,00 ± 0,05 с шагом 1,00. Проводят встряхивание в течение 30 минут, после чего оставляют на 7 дней. По истечении указанного времени содержимое колб фильтруют и определяют содержание аминокислот в фильтрате методом перевода аминокислот в растворимые медные соли и их последующем фотометрическом определение, измеряют рН после адсорбции.