Единицы ферментативной активности

За единицу ферментативной активности (Е) принимают количество фермента, катализирующего превращение 1 микромоля субстрата за 1 мин:

, (1)

где М – количество превращенного субстрата, мкмоль;

t – время инкубации, мин.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено выражать активность фермента в каталах (кат, kаt): Е_кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с. (1 моль/с). Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 с×моль^–1 = 60 моль мин^–1 10×= 60⁶ мин–1×мкмоль 10×= 6^–7 мин×Е, или 1Е = 1 мкмоль^–1 = (1/60) мкмоль е^–1 = (1/60) мккат =16,67 нкат. Таким образом, 1Е фермента соответствует 16,67 нкат.

Для выражения активности в практической работе с ферментами пользуются понятиями удельной и молярной активности.

Удельную активность фермента определяют путем деления числа единиц ферментативной активности на массу белка (или ткани), г или мг.

, (2)

где Е – число единиц ферментативной активности;

m – масса белка (ткани), г или мг

Молярную активность фермента определяют путем деления числа единиц ферментативной активности в образце на массу фермента, выраженную в микромолях (для очищенных ферментов):

, (3)

где Е – число единиц ферментативной активности;

m – масса фермента, мкмоль.

 

13. Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам.

Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ: ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4) ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локализацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда является повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.

Креатинфосфокиназа (КФК) — фермент, участвующий в реакциях энергообразования и содержащийся в наибольшем количестве в сердечной и скелетной мускулатуре. Чаще всего анализ активности этого фермента проводят при инфаркте миокарда, так как он очень чувствителен и специфичен.

Нормальная активность в сыворотке крови — до 100 нМ/с • л

или до 6 МЕ.

Повышение активности отмечается при различных повреждениях сердечной и скелетной мускулатуры — инфаркте миокарда, миокардите, аритмии сердца, прогрессирующей мышечной дистрофии, а также при нарушении мозгового кровообращения, интенсивной нагрузке, приеме алкоголя и некоторых лекарств.

Практически все ферменты имеют молекулярные разновидности — изоферменты. У каждого фермента имеется их определенное количество—от 2-х до 10. Определение изоферментов — достаточно сложный анализ, который проводится не во всех лабораториях, однако он значительно более информативен, чем общая активность.

У КФК имеется 3 изоформы. В норме они имеют соотношение

I(ВВ) — 0 —следы,

II (МВ) — 4-6%,

III (ММ) — 94-96%.

Увеличение II (МВ) изоформы происходит в течение первых суток после инфаркта миокарда и 100% подтверждает этот диагноз, однако уже через 2-3 суток происходит нормализация активности фермента, и спустя 2-3 дня после развития инфаркта такой анализ уже не назначается.

Лактатдегидрогенеза (ЛДГ) — фермент, участвующий в одном из конечных этапов превращения глюкозы с образованием молочной кислоты. Находится во всех органах и тканях, поэтому диагностическое значение имеет определение изоферментов ЛДГ, так как отдельные изоформы характеризуют преимущественно определенные органы.

Нормальный изоферментный спектр сыворотки крови:

ЛДГ1 — 30-36%,

ЛДГ2 — 40-50%,

ЛДГ3 — 14-20%,

ЛДГ4 — 0-4%,

ЛДГ5 — 0-2%, '

ЛДГ2/ЛДГ1 - 1,2-1,5.

Определение изоферментного спектра ЛДГ чаще всего назначается при патологии печени и сердца, реже — легких. Так, при инфаркте миокарда в течение первых 2-3 суток активность ЛДГ, значительно возрастает и соотношение ЛДГ2/ЛДГ1, становится равным 0,6-0,8. Нормализация происходит спустя 2-3 недели после инфаркта миокарда и зависит от объема поражения — чем обширнее был инфаркт, тем дольше сохраняются изменения в изоферментном спектре ЛДГ. При других заболеваниях сердца этот показатель, как правило, не меняется.

При заболеваниях печени, сопровождающихся повреждением клеток (гепатиты, токсические воздействия, метастазы в печень) отмечается увеличение активности фракций ЛДГ4 и ЛДГ5.

Щелочная фосфатаза (ЩФ) — фермент, аналогичный по функции кислой фосфатазе, но проявляющий максимальную активность в щелочной среде. Содержится в большом количестве в стенках желчных протоков печени, костях, слизистой оболочке кишечника, плаценте, почках. Анализ назначается при патологии именно этих органов и тканей.

Нормальная активность в сыворотке крови — 32-92 ЕД/л или

278-890нМ/с-л,

Анализ активности ЩФ информативен при нарушениях оттока желчи из печени, которые вызывают камни или опухоли различной локализации. В этих случаях, а также при первичном билиарном циррозе активность ЩФ существенно возрастает. Определение активности ЩФ при заболеваниях печени в совокупности с другими анализами (АсАТ, АлАТ, билирубин, у-ГТФ) позволяет более точно судить о локализации и характере патологического процесса.

Повышение активности ЩФ является характерным признаком первичного рака почки, отмечается в первую неделю инфекционного мононуклеоза, характерно для различных поражений костей — остеодистрофия, деформирующий остит, злокачественные новообразования костей и метастазы в кости.

Снижение активности ЩФ возникает, как правило, при уменышении содержания фосфора, накоплении радиоактивных продуктов в костях, выраженной анемии, гипотиреозе.

 

Мультиферментные комплексы

Мультиферментные комплексы это надмолекулярные образования которые включают, несколько ферментов и коферментов. Они катализируют последовательные этапы реакции преобразования одного субстрата. Примером мультиферментов являются реакции окисли тельного декарбоксилирования αкетокислот (пирувата и αкетоглутарата) под влиянием пи руватдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы. Например пируватдегидрогеназный комплекс включает 3 фермента и использует 5 коферментов

Биологическое значение мультиферментных комплексов состоит в том, что благодаря их существованию облегчается перенос реагирующих веществ между отдельными фермен тами и коферментами, что ускоряет протекание реакций. Мультиферментные комплексы, как правило, формируются на мембранах путем самосборки.

В мультиферментном комплексе несколько ферментов прочно связаны между собой в единый комплекс и осуществляют ряд последовательных реакций, в которых продукт реакции непосредственно передается на следующий фермент и является только его субстратом. Благодаря таким комплексам значительно ускоряется скорость превращения молекул.