XI. Ферментные системы антиоксидантной защиты

Супероксиддисмутаза

Супероксиддисмутаза (СОД) — важнейший энзим антирадикальной защиты. Фермент обнаружен во всех аэробных организмах. В организме млекопитающих идентифицировано две изоформы СОД: Mn-СОД (СОД2), локализованная в митохондриальном матриксе, и Cu²⁺/Zn⁺ -СОД двух типов, находящейся либо внутри клеток (в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий) в виде димера (СОД1), либо во внеклеточной жидкости (СОД3) в виде тетрамера. СОД на три-четыре порядка ускоряет реакцию диспропорционирования О₂^∙- (супероксидных анионов).

Реакция дисмутации с участием Cu,Zn-СОД идёт в две стадии, в ходе которых происходит перенос электронов с одного супероксидного анион-радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди.

E- Cu²⁺ + О₂^∙- + H⁺® E-Cu⁺ + O₂

E- Cu²⁺ + О₂^∙- + H⁺®E-Cu⁺ + H₂O₂

Супероксиддисмутазы обладают узкой субстратной специфичностью, действие их направлено только на полувосстановленную молекулу кислорода.

СОД может взаимодействовать также с пероксидом водорода и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов - супероксида и гидроксила:

Cu²⁺ -СОД + Н₂О₂® Сu⁺ -СОД + О₂ ^∙- + 2Н⁺;

Cu⁺ -СОД + Н₂О₂® Сu²⁺ -СОД + ОН^-+ ^·НО

Неорганические перекиси ингибируют СОД, необратимо восстанавливая медь в составе её активного центра. В отличие от неорганических липидные перекиси обратимо ингибируют СОД. Эффективным ингибитором фермента является гидроперекись линоленовой кислоты, снижающая её активность в 3,5 раза.

Супероксиддисмутаза играет важную роль в защите клеток от повреждающего действия супероксидного анион-радикала и по праву считается главным ферментом внутриклеточной АОС. СОД не только стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы перекисного окисления липидов. Снижая уровень О₂^∙-, она защищает от его дезактивирующего действия каталазу и глутатионпероксидазу.

Регулирующее влияние на активность СОД оказывают глутатион, цистеин, другие SH-содержащие соединения, а также опосредованно ферменты глутатионового обмена; последние, наряду с каталазой и пероксидазами различной субстратной специфичности, обеспечивают детоксикацию пероксида водорода.

Издержками этого ферментативного процесса является образование перекиси водорода, способной образовывать высокореакционные гидроксильные радикалы, но восстанавливаемая до воды в основном каталазой и глутатионпероксидазой.

 

Каталаза

Каталаза – хромопротеин с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4 субъединиц, имеющих по одной группе гема, локализуется в основном в пероксисомах, частично – в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к перекиси водорода и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация перекиси водорода высока, каталаза активно разрушает ее.

Разложение перекиси водорода каталазой осуществляется в два этапа:

Fe³⁺-каталаза + 2 H₂O₂→ окисленная каталаза + H₂O₂→ Fe³⁺-каталаза + H₂O₂+ O₂

При этом в окисленном состоянии каталаза работает как пероксидаза. Субстратами в пероксидазной реакции могут быть этанол, метанол, формиат, формальдегид и другие доноры водорода.

Следует отметить, что около 0,5% кислорода, образующегося в результате разложения перекиси водорода, возникает в возбужденном, синглетном состоянии и таким образом в процессе разложения перекиси водорода вновь генерируются активные формы кислорода.

Каталаза в клетках, в частности, в эритроцитах, находится в едином комплексе с СОД, поэтому совместное действие этих антиоксидантных ферментов может быть представлено в виде единой реакции:

O₂^-∙+ 2H^{+ СОД} H₂O₂ ^{каталаза}Н₂О +О₂

Таким образом, совместное действие СОД и каталазы обеспечивает надежную защиту организма от токсического действия высоких концентраций супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, но, в то же время, поддерживает минимальный (ниже 50,0 мкМ) контролируемый уровень этих соединений необходимых в физиологических условиях для осуществления многих клеточных процессов. В случае необходимости изменение активности одного из ферментов может резко изменить и уровень перекиси водорода. Так, например, при стимуляции фагоцитоза резко возрастает активность СОД, что приводит к образованию повышенных количеств перекиси водорода, которая используется для создания самых мощных деструктивных факторов фагоцитоза – гидроксильного радикала и гипохлорит-иона.

 

Глутатионпероксидаза

Глутатионпероксидаза (ГПО) -важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). ГПО – гомотетрамерный селенопротеин, имеет молекулярную массу около 74 кДа, состоит из 4 идентичных субъединиц, в состав активного центра входит селен, который содержится в виде Se-цистеина. Селен необходим для синтеза глутатионпероксидазы.

Рис.9. Структурная формула глутатиона

Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу. Ген глутатионпероксидазы локализован в 3-й хромосоме. Глутатионпероксидаза катализирует реакции, в которых фермент восстанавливает пероксид водорода до воды, а также восстановление органических гидропероксидов (ROOH) до гидроксипроизводных, и в результате переходит в окисленную дисульфидную форму GS-SG:

2GSH + H₂O₂®GSSG + H₂O

2GSH + ROOH®GSSG + ROH +H₂O

Окисленный глутатион (GSSG) восстанавливается в глутатионредуктазной реакции с участием NADPH.

Рис. 10. Схема восстановления окисленного глутатиона.

Глутатионпероксидаза обезвреживает не только H₂O₂, но и разные органические липидные пероксилы, которые образуются в организме при активации ПОЛ. Такие как гидропероксиды линолевой и линоленовой кислот, холестерин-7β-гидропероксид и некоторые синтетические вещества (кумен-, трет-бутил-гидропероксиды). Глутатионпероксидаза защищает от окислительной атаки белки, липиды, никотинамидные коферменты, восстанавливает липидные перекиси.

Помимо способности восстанавливать пероксид водорода и гидропероксиды жирных кислот, ГОП обеспечиваетзащиту аэробных организмов и от чрезвычайно токсичного пероксинитритапутем восстановления его до нитрит-аниона:

Рис. 11. Предполагаемый каталитический механизм восстановления пероксинитрита глутатионпероксидазой.

Фермент глутатионпероксидаза локализирован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. В тканях млекопитающих максимальная активность глутатионпероксидазы в печени, эритроцитах, надпочечниках. Активность фермента зависит от количества образованных пероксидов. Функционирует сопряженно сглутатионредуктазой.

Рис.12. Схема механизма работы глутатион-редокс системы.

Главной ферментативной системой плазмы крови является ГПО внеклеточных жидкостей и ГПО гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфатидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности, восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации. Кроме того, ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл.

Глутатион-S-трансферазы.

Глутатион-S-трансферазы представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая: 1) каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с GSH; 2) некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-гидропероксидов через экспрессию активности GSH-пероксидазы. Кроме того, глутатион-S-трансферазы изомеризуют некоторые стероиды и простагландины, участвуют в метаболизме других эндогенных веществ. В частности, GST могут вовлекаться в синтез лейкотриенов, поддерживая процесс воспаления.

Восстановленный глутатион (GSH) – низкомолекулярный тиол, преобладающий (90–95%) во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1–10 ммоль) выше, чем концентрация большинства органических веществ. GSH представляет собой трипептид (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин), состоящий из глицина, цистеина и глутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через карбоксильную группу.

В отличие от ГПО GST не способна восстанавливать перекись водорода, но подобно мономерной ГПО весьма эффективно восстанавливает гидропероксиацилы мембранных фосфолипидов, а также подобно тетрамерной ГПО восстанавливает свободные гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот, образовавшиеся в результате гидролиза окисленных фосфолипидов фосфолипазой А2. Восстановление гидроперекисей полиеновых жирных кислот как свободных, так и находящихся в структуре мембранных фосфолипидов протекает по схеме:

ROOH + GSH ^GST ROH + G-SOH

Нестойкое сульфеновое производное глутатиона (G-SOH) способно взаимодействовать еще с одной молекулой глутатитона с образование дисульфида окисленного глутатиона:

G-SOH + G-SH GS-SН + H2O,

далее действует глутатионредуктаза.

GST не конкурентна в своих действиях ГПО. Полагают, что в нормальных физиологических условиях, когда фосфолипаза А2 малоактивна, контроль за уровнем липопероксидов в клетке осуществляется преимущественно GST, способной напрямую восстанавливать мембранные фосфолипиды. В условиях патологии, когда вследствие ацидоза и повышения уровня внутриклеточного Са2+ активируется фосфолипаза А2 и отщепляются свободные гидроперекиси полиеновых жирных кислот, действует «классическая» тетрамерная ГПО. Таким образом, глутатионзависимые антиоксидантные ферменты – ГПО и GST играют важную роль в репарации мембранных структур после их свободнорадикального повреждения. Кроме этого, установлено, что GST также способствует конъюгированию с G-SH токсичных конечных продуктов ПОЛ, что способствует их выведению из организма.

Рис.13. Схема работы ферментативной антиоксидантной системы при восстановлении кислорода до воды.

Церулоплазмин

Церулоплазмин — энзим плазмы крови гликопротеидной природы, прочно связывающий до шести атомов меди (Cu²⁺), что обеспечивает секвестрирование до 95% ионов данного металла из их общего количества в крови. Церулоплазмин (часто обозначается как ферроксидаза) с высокой скоростью катализирует окисление ионов двухвалентного железа:

ЦП–Cu²⁺ + 4Fe²⁺ → ЦП–Cu⁺ + 4Fe³⁺

ЦП–Cu⁺ + O₂ + 4H⁺ → ЦП–Cu²⁺ + 2H₂O

Ионы металлов переменной валентности способны эффективно катализировать продукцию прооксидантов, в частности гидроксильного радикала (∙ OH). Для обеспечения адекватной антиоксидантной защиты организма чрезвычайно значимо удержание их уровня в биосредах в пределах безопасных концентраций и в окисленном состоянии.

Способствуя встраиванию в ферритин окисленного Fe³⁺, ЦП ингибирует супероксидное и ферритин-зависимое перекисное окисление липидов. Описанные выше свойства ЦП послужили основой для объяснения его противовоспалительной активности, что вместе с быстрым возрастанием концентрации ЦП (в 2-3 раза) в русле крови уже в начале воспалительной реакции позволяет причислить его к белкам “острой фазы”.

Трансферрин

Трансферрин — гликопротеин плазмы крови, прочно, но обратимо связывающий катионы железа, обеспечивает транспорт данных ионов в организме млекопитающих. Полипептидная цепь молекулы трансферрина состоит обладает двумя сайтами связывания Fe³⁺.

Синтезируется трансферрин, главным образом, в печени. Уровень экспрессии данного Fe³⁺-связывающего белка определяется содержанием железа в биосредах организма — увеличивается при железодефицитных состояниях и снижается при избытке данного металла переменной валентности. Насыщенный Fe³⁺ трансферрин может проникать путем эндоцитоза только в те клетки, на цитоплазматической мембране которых экспрессируется специфический трансферриновый рецептор (TFR-1).

Совместно с ЦП усиливает связывание ионов железа с трансферрином, а в случае их высокой концентрации в плазме крови - и с ферритином. Считается, что белки плазмы крови церулоплазмин и трансферрин совместно с тканевым ферритином формируют феррокинетическую систему, главную антиоксидантную систему, контролирующую процессы ПОЛ, индуцированные ионами двухвалентного железа.Действуя как ферроксидаза, церулоплазмин выполняет важнейшую роль в регуляции ионного состояния железа - окислении Fe²⁺ в Fe³⁺. Это делает возможным включение железа в трансферрин без образования токсических продуктов железа.

Хелатные соединения, обладающие способностью связывать ионы металлов переменной валентности (ферритин, гемосидерин, трансферрины, церулоплазмин, молочная и мочевая кислота), являются важнейшей составной антиоксидантной системы организма, так как нейтрализуют основные катализаторы свободнорадикального окисления в организме.

Железо, высвободившееся из трансферрина, связывается специфическим белком ферритином, который доставляет железо в митохондрии, где оно включается в состав гема с участием феррохелатазы. Запасание железа в окисленной форме препятствует его вовлечению в окислительные процессы.