Раздел I. Методы обследования в гематологии

В гематологии для диагностики заболеваний и синдромов наряду с общеклиническими методами обследования используются и специальные. Первичный диагноз гематологического заболевания можно предположить по результатам развернутого анализа крови. Однако для полной верификации диагноза используются дополнительные методы.

Пункция костного мозга

Пункция костного мозга производится при заболеваниях системы крови для оценки клеточного состава костного мозга и его функционального состояния, установления диагноза и уточнения стадии заболевания (рецидив, ремиссия при лейкозах), оценки эффективности проводимой терапии, исключения (или подтверждения) фазы лейкемизации злокачественных лимфом, обнаружения метастазов рака.

Наиболее часто для получения костного мозга делают прокол специальными иглами грудины. Данный метод был предложен в 1927 году М. И. Аринкиным. Прокол грудины осуществляют в области рукоятки грудины или на уровне 3–4 межреберий путем аспирационной биопсии. Количество извлекаемой жидкости зависит от вида исследований, для диагностики и верификации диагноза достаточно 0,1–0,2 мл, если же планируются дополнительно иммунологические, цитогенетические, цитохимические, культуральные исследования объем жидкости увеличивают до нескольких миллилитров костного мозга.

В костно-мозговой жидкости определяют клеточность, количество мегакариоцитов, популяционный и субпопуляционный состав клеток.

Клеточный состав костного мозга называется миелограмма. В норме, в состав миелограммы входят все ядросодержащие клетки нейтрофильного ряда, начиная с миелобластов и заканчивая сегментоядерными нейтрофилами (в среднем 60,8 %), все эозинофилы и базофилы (3,2 % и 0,2 % соответственно), клетки эритроидного ряда от эритробласта до оксифильного нормобласта (20,5 %), моноциты (1,9 %), лимфоидные элементы (9 %), а также плазмоциты, мегакариоциты. Отмечают наличие тучных клеток, макрофагов, остеобластов, остеокластов и др.

Таблица 1

Клеточный состав костного мозга в норме
по Грибовой И. А., Воробьеву А. И., 2002г

Показатели миелограммы	Среднее значение, %	Абсолютное значение
Ретикулярные клетки	0,9	0,1–1,6
Бласты	0,6	0,1–1,1
Миелобласты	1,0	0,2–1,7
Нейтрофильные клетки: промиелоциты	2,5	1,0–4,1
миелоциты	9,6	7,0–12,2
метамиелоциты	11,5	8,0–15,0
палочкоядерные	18,2	12,8–23,7
ceгментоядерные	18,6	13,1–24,1
Все нейтрофильные элементы	60,8	52,7–68,9
Эозинофилы (всех генераций)	3,2	0,5–5,8
Базофилы	0,2	0–0,5
Эритробласты	0,6	0,2–1,1
Пронормоциты	0,6	0,1–1,2
Нормоцитыбазофильные	3,0	1,4–1,6
полихроматофильные	12,9	8,9–16,9
оксифильные	3,2	0,8–5,6
Все эритроидные элементы	20,5	14,5–26,5
Лимфоциты	9,0	4,3–13,7
Моноциты	1,9	0,7–3,1
Плазматические клетки	0,9	0,1–1,8
Количество мегакариоцитов (клеток в 1 мкл)		50–150
Лейкоэритробластическое отношение	3,3	2,1–4,5
Индекс созревания нейтрофилов	0,7	0,5–0,9
Количество миелокариоцитов (тыс. в 1 мкл)	118,4	41,6–195,0

Отношение клеток белого ростка к клеткам красного ряда определяется как лейкоэритробластическое отношение и в норме составляет 4 (3): 1. Дополнительно могут определяться индексы созревания нейтрофилов (0,6–0,8) и эритрокариоцитов (0,8–0,9) (Воробьев А. И., 1985; Абрамов М. Г., Воробьев А. И., 2002).

В миелограмме, кроме количественного анализа клеточного состава проводят качественный анализ популяционных и субпопуляционных рядов клеток. Клеточность пунктата костного мозга описывается как нормоклеточная, гиперклеточная, сниженная клеточность пунктата костного мозга или повышенная, или умеренная. В дальнейшем анализируется каждый клеточный росток с описания в целом, затем выделяются популяции клеток, численность которых не находится в нормальных пределах. Описываются особенности их морфологии, созревания, наличия патологических включений (Коленкин С. М., Михеева А. И., 1999). Таким образом, после тщательного количественного и качественного анализа миелограммы можно обнаружить изменения в системе крови и сформулировать предполагаемый диагноз. Миелограмма является важнейшим дополнением к развернутому анализу крови, выявленные нарушения в периферической крови сочетаются с изменениями в центральных органах кроветворения и указывают на наличие у больного заболевания системы крови.

Изучение морфологии и функции клеток костного мозга и крови

Данный анализ можно проводить, начиная с бластных клеток (Чертков И. Л. и др., 2002). Бластные клетки предшествуют созревающим и зрелым клеткам костного мозга и подразделяются на бласты миелоидной и лимфоидной линий. Миелоидные бластные клетки включают миелобласты, монобласты, эритробласты и мегакариобласты. Миелобласты подразделяются в свою очередь на 3 гранулоцитарных типа: бласты нейтрофильные, базофильные и эозинофильные. Лимфоидные клетки также имеют бласты, предшествующие В- и Т-лимфоцитам, Т-лимфобласты и В-лимфобласты. В дальнейшем изучаются созревающие и зрелые клетки каждого гематологического ряда и их функции. От миелобласта процесс созревания идет через промиелоцит, миелоцит, метамиелоцит, палочкоядерные клетки, сегментоядерные клетки. Основная функция зрелых клеток во врожденной неспецифической защите организма (в фагоцитозе к бактериальным, паразитарным и.т. д. другим агентам), кроме этого оценивается секреторная их функция, участие базофилов в реакциях гиперчувствительности замедленного типа и т. д.

От монобласта дифференцировка через промоноцит к моноциту, основная функция – неспецифическая антибактериальная защита, фагоцитоз. От лимфобласта созревание через пролимфоцит к лимфоциту, или от плазмобласта через проплазмоцит к плазмоциту, основная функция обеспечение клеточного и гуморального иммунитета организму. От мегакариобласта дифференцировка через промегакариоцит, мегакариоцит и зрелый тромбоцит, основная функция – участие в гемостазе. Созревание эритроцита происходит от эритробласта через пронормоцит, нормоцит базофильный, нормоцит полихроматофильный, нормоцит оксифильный, ретикулоцит (с остатками ядра), основная функция – заключается в снабжении тканей кислородом и транспорте углекислоты, которая осуществляется за счет присутствия в клетке гемоглобина. Таким образом, координированное взаимодействие клеток крови, опосредованное влиянием регуляторов пролиферации и дифференциации – цитокинов, обеспечивает постоянство клеточного состава крови и равновесие внутренней среды организма.

Трепанобиопсия костного мозга

Трепанобиопсия костного мозга, изучение стромального микроокружения, их организация и участие в гемопоэзе – следующий диагностический метод в гематологии.

Гемопоэз осуществляется при взаимодействии клеток костного мозга со стромой. Гемопоэтическая стволовая клетка является родоначальницей всех клеток крови. Процессы, лежащие в основе самоподдержания, коммитирования, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, определяются регуляторными механизмами на уровне генома и эпигеномными факторами. Среди последних, наибольшее значение имеют межклеточные взаимодействия гемопоэтических предшественников с элементами стромального микроокружения, которые представлены в костном мозге синусоидальными сосудами, ретикулярными, жировыми и эндостальными клетками (Ругаль В. И. и др., 1991; Mayany H. et al., 1992; Van Damme A. et al, 2002). Межклеточные взаимодействия реализуются через прямые контакты с клетками-предшественницами и через цитокины и другие биологически активные молекулы, которые продуцируются стромой. Результатом взаимодействия является запуск экспрессии генов в ядре, с последующей клеточной пролиферацией и дифференцировкой. Трепанобиопсия – способ изучения костного мозга и стромы (Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М., 1977). С помощью трепанобиопсии костного мозга можно оценить соотношение кроветворной и жировой тканей, изменения со стороны костной ткани, стромы костного мозга и гемопоэтического микроокружения. Таким образом, данный метод позволяет дополнительно оценить изменения изменения костного мозга при заболеваниях системы крови.

Цитохимия клеток крови и костного мозга

Данный метод используется для диагностики лейкозов. В основе метода используются различные цветные химические реакции, направленные на выявление метаболически активных веществ. Лейкозные клетки имеют не только морфологические, но и метаболические особенности. Идентификация лейкозных клеток, и, соответственно верификация острого лейкоза основана на обнаружении метаболических аномалий. Наибольшее диагностическое значение имеют ферменты – миелопероксидаза, кислая и щелочная фосфатазы, неспецифические эстеразы, липиды и углеводы. Для осуществления цитохимической диагностики лейкозов широко используются следующие цитохимические реакции:

1. Определение содержания полисахаридов в PAS-реакции по методам McManus (1946), R. D. Hotchkiss (1948) (Лецкий В. Б., 1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000).

2. Определение содержания фосфолипидов в реакции с Суданом черным Б, по методам Shneehan и Storey (1947); Ackerman (1952).

3. Определение активности миелопероксидазы по методу Sato (1928) и Quaglino (1958), W. Loele (1936) (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Лецкий В. Б., 1973).

4. Определение активности хлорацетат-эстеразы по методу Moloney с соавт. (1960).

5. Определение активности кислой фосфатазы по методам Р. П. Нарциссова (1968); Гольдберга и Барка (1962); Берстона (1958).

6. Определение активности а-нафтилацетат-эстеразы по методам Хейхо с соавт. (1964); Э. Пирса (1960) в модификации Леф- флера(1961).

7. Определение активности щелочной фосфатазы по методам Kaplow (1955); Ф. Г. Дж. Хейхо. Д. К. Кваглино (1958); М. Г. Шубич (1967), ЛецкийВ. Б., (1973); Глузман Д. Ф. и др., (2000); Хей- хо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К. (1983).

Несмотря на то, что данный метод диагностики используется с середины XX века, он не потерял своей актуальности, и позволяет точно идентифицировать морфологический вариант острого лейкоза.

Использование клеточных культур

Совокупность живых, жизнеспособных клеток, выращенных вне организма хозяина, составляют клеточную культуру. Клетки, способные пролиферировать, образуют клон однотипных клеточных элементов, а метод называют клонированием. Использование методов клонирования кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга впервые началось в 70-х годахXXстолетия (J. E. Till, Е. A. McCulloch (1961), A. J. Friedenstein и соавторов (1968), Т. R. Bradley, D. Metcalf (1966).

Культуральными методами изучили особенности функционирования стволовых кроветворных клеток, клеток-предшественников и их потомства, медиаторов кроветворения, было доказано наличие клоногенных свойств стволовых клеток и предшественников стромы костного мозга, дана характеристика колониеобразующим единицам, то есть тем клеткам, которые способны вне организма давать рост колоний, были изучены кинетика гемопоэтических клеток, апоптоз и т. д. В настоящее время разрабатываются и унифицируются методы стандартизации и оптимизации культуральных сред и условий культивирования для более широкого практического использования культур и исключения неточностей и ошибок при проведении культуральных методов.

Цитогенетический метод

Цитогенетический метод направлен на обнаружение генетических аномалий опухолевых клеток при гемобластозах. Наиболее широкое применение для молекулярной диагностики гемобластозов получили методы FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Метод FISH основан на способности хромосомной ДНК-мишени связываться с отрезками ДНК-зонда, содержащими комплементарные ДНК-мишени последовательности. ДНК-мишенью при FISH является ядерная ДНК интерфазных клеток или ДНК метафазных хромосом, нанесенных на стекло.

ПЦР- метод амплификации (многократного копирования) специфических последовательностей ДНК с помощью специфического фермента – термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-noлимераза). ПЦР представляет собой циклический процесс, включающий фазы денатурации ДНК, отжига (присоединение праймеров) и синтеза заданных участков ДНК. Чувствительность ПЦР-метода высока, возможно выявление одной опухолевой клетки с аномальной ДНК- или РНК среди 10¹¹ нормальных клеток. В настоящее время доказано, что появление гемобластоза сопровождается генетическими изменениями кариотипа. Цитогенетические исследования повышают количество надежных прогностических факторов, способствующих подбору и оценке адекватности терапии этим пациентам. При остром лимфобластном лейкозе наиболее часто встречаются первичные хромосомные аберрации (Абдулкадыров К. М. и др., 2004), представленные в таблице 2.

При остром нелимфобластном лейкозе в зависимости от варианта выделяют следующие изменения кариотипа (Абдулкадыров К. М. и др., 2004) (табл. 3).

Таблица 2

Первичные хромосомные аберрации при ОЛЛ

Нарушение	Вовлекаемые гены	Типичный иммунофенотип
t(l;ll)(p32;q23)	AF1P;MLL	Mixed lineage
t(l;19)(q23;pl3)	РВХ!;Е2А	Mixed lineage
Dup(l)(ql2-21q31-32)	Не определены	Prc-B, B-cell
t(2;8)(pl2;q24)	IGK;MYC	B-cell
t(4;ll)(q21;q23)	AF4:MLL.	Early B-precursor,
del(6q)	MYB	Biphenotypic
+8	Не определены	B- or T-lineage
t(8;14)(q24;qll)	MYCTCRA/	B- or T-lineage
t(8;14)(q24;q32)	TCRD	T-lineage
t(8;22)(q24;qll)	MYC;IGH	B-cell
del(9p)	MYCIGL	B-cell
T/dic(9;12)(pll-13)	Не определены	B- or T-lineage
i(9q)	Не определены	Pre-B
t(9;22)(q34;qll)	Не определены	Pre-B
t(10;14)(q24;qll)	ABL;BCR	B-lineage.
t(ll;14)(pl5;qll)	HOXlhTCRD	T-lineage
t(ll;14)(pl3;qll)	RBTN1:TCRD	T-lineage
T/dcl(12p)	RBTN2;TCRD	T-lineage
t(14;18)(q32;q21)	He определены	B- or T-lineage
i(17q)	TGH;BCL2	B-lineage
-20	He определены	Mixed lineage
+21	He определены	B-lineage

Приблизительно у 95 % больных с клинико-морфологическими признаками хронического миелолейкоза выявляется специфический маркер – филадельфийская (Ph') хромосома, образующаяся в результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql 1). Примерно в 5 % случаев
Ph'-хромосома является результатом сложных или простых вариантных (атипичных) транслокаций t(9;22). При сложных транслокациях в перестройках участвуют три и более хромосом, причем две из них – 9-я и
22-я – постоянно.

Таблица 3

Первичные хромосомные аберрации при ОНЛЛ

Вариант заболевания*	Типичные хромосомные нарушения
Ml	del или t с 3q26 и 1р36, 2р13-22, 5q31-35
М2	t(8;21)(q22;q22)
МЗ	t(6;9)(p23;q34) (с базофилией)
М4	del(2)(p23)Hdel(2)(p21)
М5	t(15;17)(q22;q21)
М6	inv(16)(pl3q22) (с эозинофилией)

* При всех вариантах заболевания встречаются следующие аберрации: -5 илиdel(5q); -7 или del(7q): +8

У больных множественной миеломой аномалии кариотипа обнаруживаются, по различным сообщениям, в 20–60 % исследованных случаев. Из них у 30 % пациентов обнаруживается гиподиплоидия, у 30 % – псевдодиплоидия и у 30 % – гипердиплоидия. Типичными для данного варианта заболевания являются: моносомия 13, трисомии 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19.

Среди структурных нарушений чаще других выявляется 14q+ маркер, присутствующий у 30 % пациентов с цитогенетическими аномалиями. В перестройки вовлекается локус 14q32, аберрации которого при молекулярно-гснетическом исследовании FISH обнаруживаются у 75 % больных с аномальным кариотипом в два раза чаще, чем при цитогенетическом. Как правило, локус 14q32 вовлекается в транслокацию t(II;14)(ql3;q32). Приблизительно у 30 % пациентов с аберрациями выявляются аномалии 1р11-22. С вовлечением данного локуса описаны транслокации, делеции – терминальная и интерстициальная, а также частичная дупликация (Абдулкадыров К. М. и др., 2004).

Таким образом, проводимые цитогенетические исследования при гемобластозах позволяют не только верифицировать диагноз, но и оценить прогноз данного варианта заболевания, адекватность и эффективность проводимой терапии.

Иммуногематологический метод

Оценивается иммунный статус больного, проводится иммунофенотипирование лейкозных клеток, изучаются антитела и антигены крови, их роль в возникновении и прогрессировании заболевания, осуществляется прогнозирование заболевания исходя из иммунологических особенностей. Иммунодеффицитные состояния, развивающиеся при гемобластозах, вторичные и обусловлены наличием основного заболевания. При изучении клеточного звена иммунитета проводят количественную оценку лимфоцитов и их субпопуляций, оцениваются продуцируемые клетками эффекторные цитокины.

Наиболее значимыми кластерами дифференцировки для определения Т-лимфоцитов являются CD3 и CD7, для Т-хелперов – CD4, для Т-цитотоксических/супрессорных клеток – CD8 соответственно.

Для характеристики В-лимфоцитов используют маркеры CD19, CD20, CD21, CD22, CD24 и CD72, а также определяют экспрессию поверхностных иммуноглобулинов (slg).

Для NK-клеток применяют маркеры CD 16, CD56 и CD57. CD16 – маркер, который присутствует практически на всех гранулоцитах и на некоторых моноцитах.

Маркерами миелоидных клеток являются CD13, CD14 (экспрессируется на моноцитах), CD15 и CD33. На мегакариоцитах и тромбоцитах экспрессированы молекулы CD41 и CD42, которые играют существенную роль в адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосудов.

Наиболее важными маркерами гемопоэтических стволовых клеток являются CD34 и CD117. Кроме того, на всех кроветворных клетках выявляются молекулы CD45. Для большинства цитокинов в настоящее время также установлены рецепторы, в соответствии с кластерами дифференцировки (Фрейдлин И. С, Тотолян А. А., 2001). Наилучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитофлуориметрия, которая в короткие сроки определяет количество и частоту множества субпопуляций лимфоцитов.

Важные свойства цитокинов

Абдулкадыров К. М. и др., 2004 г.

- Индуцибельность – генетически детерминированная зависимость выработки цитокинов от стимулирующих воздействий.

- Локальность функционирования – действие цитокинов происходит в определенном микрообъеме (местно), куда проникает инфекционный агент (носитель антигена) и где активируются клетки-продуценты цитокинов и клетки-мишени.

- Избыточность – каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов и каждая разновидность цитокинов может секретироваться разными клетками.

- Взаимосвязанность и взаимодействие компонентов.

Цитокины разнородны по своим функциям. Гемопоэтины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических предшественников. Интерфероны, осуществляющие естественную защиту организма от вирусов. Факторы некроза опухоли, обладают провоспалительными, иммуностимулирующими и многими другими свойствами. Хемокины, привлекают в очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты из циркулирующей крови. «Бессемейственные» цитокины, не отнесены пока к какому- либо семейству. (Ярилин А. А., 1997).

Также выделяют провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа, ИНФ и др), воздействующие на ранней стадии воспалительного процесса и усиливающие воспаление.

Противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, тканевой фактор роста (ТФР) и др.) подавляют воспаление в месте действия. В зависимости от характера влияния на гемопоэз цитокины разделяют на позитивные и негативные регуляторы. К позитивным относят фактор стволовой клетки, различные колониестимулирующие факторы, зритропоэтин и целый ряд интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-11 и др.), которые стимулируют соответствующие ростки кроветворения и способствуют пролиферации клеток. К негативным факторам относят ФНО, ИНФ, ТФР и др., которые угнетают кроветворение. Выделяют цитокины, защищающие клетки от апоптоза (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-10, факторы роста) и индуцирующие апоптоз (ФНОа, ИНФ-γ, ИЛ-1 и др.);

При изучении гуморального звена иммунитета определяем концентрации и соотношение сывороточных и секреторных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, IgD и IgE).

Для оценки неспецифического звена иммунитета изучается фагоцитоз нейтрофильных гранулоцитов, система комплимента и относительное и абсолютное количество естественных клеток-киллеров. При изучении иммунитета используются методы проточной цитометрии, непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к различным поверхностным антигенам клеток. Таким образом, комплексное изучение иммунной системы у больных гемобластозами, позволяет прогнозировать прогрессирование заболевания, осуществлять иммунологический контроль при проведении терапии коррекции осложнений.

Иммуногистохимический метод

Иммуногистохимический метод используется в диагностике гемобластозов, в его основе лежит оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело в биопсийной ткани. Выявление антигена (биопсийного компонента клеточных структур или межклеточного вещества) с помощью специфических готовых флюоресцентных антител приводило к появлению реакции, которая визуально выявляется при использовании флюоресцентного микроскопа. Особенностью иммуногистохимического метода является специфичность данного исследования, изучается не только наличие реакции антиген-антитело, но и пространственная локализация выявленных изменений в биопсийном материале.

Иммуногистохимические методы в морфологической диагностике позволяют решать следующие главные задачи (Абдулкадыров К.М. и др., 2004):

1. Уточнение гистогенеза опухолей.

2. Определение характера патологического процесса в плохо сохранившихся биоптатах или биоптатах с недостаточным объемом материала.

3. Уточнение вероятного источника метастазирования.

4. Оценка функционального состояния клеток опухоли.

5. Иммунофенотипирование опухолей кроветворной и лимфоидной тканей.

6. Диагностика иммунокомплексных и аутоиммунных заболеваний (гломерулопатии, буллезные дерматозы, синдром Гудпасчера и др.).

7. Поиск инфекционных агентов (токсоплазма, микобактерии, хламидии, вирусы и др.).

Заключение

Комплексное использование методов исследованияв гематологической практике (пункция костного мозга, изучение морфологии и функции клеток костного мозга и крови, трепанобиопсия костного мозга, цитохимическое исследование клеток крови и костного мозга, применения клеточных культур, цитогенетических, иммуногематологических, иммуногистохимических анализов) – позволяет: верифицировать окончательный диагноз, назначить соответствующую терапию, оценить прогноз, и, следовательно, повысить выживаемость среди больных гемобластозами.

Вопросы для самоконтроля к I разделу

1. Какие дополнительные методы исследования используются в гематологии?

2. Какой популяционный и субпопуляционный состав клеток пунктата костного мозга должен быть в норме?

3. Какова схема кроветворения?

4. Назвать функции клеток крови.

5. Чем отличается трепанобиопсия костного мозга от пункции?

6. В чем сущность цитохимического анализа клеток крови и костного мозга?

7. Какие задачи решает культуральный метод в гематологии?

8. Какие методы и в чем их сущность при цитогенетическом анализе гемобластозов?

9. Какие хромосомные аберрации выявляются при ОЛЛ и ОНЛЛ?

10. Какие изменения кариотипа диагностируются при ХМЛ, множественной миеломе?

11. Каковы особенности использования иммуногематологического метода?

12. Что такое цитокины, каковы их свойства и разновидности?

13. Какие задачи в морфологической диагностике решают иммуногистохимические методы?