Реакция непрямой гемагглютинации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.

14.1 Методика постановки РНГА. Она включает: а) приготовление сенсибилизированных эритроцитов (подготовка эритроцитов, их фиксация, танизация и сенсибилизация); б) постановку главного опыта РНГА. Обычно в ветеринарных лабораториях ставят только главный опыт, а сенсибилизированные эритроциты готовят на предприятиях биологической промышленности.

Процесс приготовления сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарного диагностикума):

1) подготовка эритроцитов. Для этой цели наиболее широко применяют эритроциты барана и человека. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц – кур, индеек, уток; приготовленные на них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общепринятым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия при центрифугировании;

2) фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны. Одна из них: 50%-ную взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50%-ного формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодическим встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (pH 7,2);

3) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты малоизучен. Однако при этом достигается главное – танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формалинизированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3%-ной взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10–15-минутного контакта при 37°С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфатным буфером (рН 7,2);

4) сенсибилизация эритроцитов. 10%-ную концентрацию эритроцитов на 0,15 М фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2–3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1%-ной концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов). Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РИГА.

Необходимо отметить, что оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена (для разных вирусов) подбирают эмпирически в пробных опытах сенсибилизации эритроцитов.

14.2 Главный опыт РНГА. Реакцию ставят в пробирках или в лунках плексигласовых панелей. В последнее время РНГА ставят микрометодом, используя аппарат Такачи (рис. 30), Титертек или автоматические пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рис. 31). Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.

Рисунок 30. Аппарат Такачи

Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физиологическим раствором с рН 7,2–7,4, содержащим 1% нормальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных антигеном эритроцитов.

Рисунок 101. Многоканальная автоматическая пипетка 1 – регулятор объема; 2– наконечники; 3 – рабочая рукоятка; 4 – сбрасыватель наконечников

Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет проводят через 2–3 ч по осаждению эритроцитов в контроле. Опыт сопровождают следующими контролями: 1) на спонтанную гемагглютинацию эритроцитарного антигена (сенсибилизированные эритроциты + физиологический раствор с 1 % кроличьей сыворотки); 2) на активность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + положительная сыворотка); 3) на специфичность сенсибилизированных эритроцитов(сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомологичная для данного антигена сыворотка); 4) на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуемые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).

Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале: (+++) – агглютинированные эритроциты образуют перевернутый «зонтик» с неровными краями; (++) – по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (+) – по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов; (–) – эритроциты оседают на дно в виде диска или колечка – отрицательный результат.

При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной – оседают в виде компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсибилизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сывороткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техники постановки и быстрота ответа (через 2– 3 ч). Однако есть и недостатки. Это трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.).