Использование в вирусологии лабораторных животных. Устройство вивариев, правила техники безопасности при работе с лабораторными животными.

4.1 Виды лабораторных животных. Наиболее широко в вирусологических лабораториях применяют мышей, бе­лых крыс, кроликов, морских свинок, хомяков, цыплят. У молодых мышей экс­периментально воспроизводят грипп, альфа- и флавивирусные инфекции, ящур (на новорожденных мышатах) и др. Они восприимчивы ко многим вирусам, их легко разводить и с ними удобно работать. Лучше использовать мышей инбредных линий, так как они почти одинаково реагируют на тот или иной вирус. У крыс также создают инбредные линии, но эти животные более устойчивы к оп­ределенным вирусным инфекциям, чем мыши. Онкогенность некоторых виру­сов широко изучают на золотистых хомячках. Для вирусологических опытов обычно используют гладкошерстных морских свинок массой 250–300 г.

Ту или иную инфекцию иногда изучают на животных нескольких видов, об­ладающих разной чувствительностью к данному вирусу, что позволяет диффе­ренцировать вирусы, вызывающие клинически сходные симптомы болезни (на­пример, ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней).

По генетическим качествам лабораторных животных делят на четыре группы:

1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие животные гетерогенны;

2) животные, полученные непосредственно из од­ного источника, однако генетически такие животные вариабельны;

3) инбредные линии животных. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности.

4) однородные гибриды F₁. Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F₁ менее изменчивы, чем обе родительские ли­нии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы.

Отрицательная сторона выделения вируса на лабораторных животных – воз­можность диагностических ошибок вследствие активации скрытого вирусоносительства. В этом случае развитие симптомов болезни после введения матери­ала не следствие действия введенного вируса, а результат самой процедуры, на­рушающей предшествующее равновесие в организме. В это время проявляется вирус или другой инфекционный агент, длительно персистирующий в организ­ме. Выражается это резкими неврологическими симптомами (повороты вдоль длинной оси тела).

Наличие скрытой вирусной инфекции может также выражаться уменьшени­ем или исчезновением чувствительности животных к исследуемому вирусу вслед­ствие явления интерференции. Возможен и противоположный эффект, а имен­но – явление синергизма в действии вирусов, что дает иногда результаты, труд­ные для правильной интерпретации.

Для некоторых вирусологических работ, например при выделении вируса с невыясненными болезнетворными свойствами, необходимо использовать гнотобиотов. Термин «гнотобиоты» объединяет две категории животных: безмик­робных (стерильных), не содержащих никаких жизнеспособных микробов, и гнотофор – носителей одного (моногнотофоры), двух (дигнотофоры) или более (полигнотофоры) микроорганизмов. В настоящее время безмикробные животные по динамике роста делятся на три группы: I – обезьяны, поросята, цыплята растут лучше обычных животных или наравне с ними; II – крысы, мыши, собаки, кошки растут наравне с обычными животными; III – морские свинки, кролики, козлята, ягнята растут хуже обычных животных.

Стерильных птиц получают посредством инкубации яиц со стерильной скор­лупой в стерильном инкубаторе, лабораторных животных – путем кесарева се­чения или гистерэктомии. Содержат животных в стерильных изоляторах. Воз­дух, вода и корм должны быть стерильными.

Особое значение среди гнотобиотов занимают СПФ-животные (Specific pathogen free), которые свободны только от патогенных микроорганизмов. В их организме имеются все необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерии и ви­русы, которые в совокупности создают группу так называемой резидентной (по­лезной) микрофлоры. В настоящее время получены лабораторные СПФ-живот­ные – крысы, морские свинки, кролики, поросята, птицы и др.

4.2 Цели использования лабораторных животных. В настоящее время лабораторных животных используют в вирусологии для:

– обнаружения вируса в патматериале;

– первичного выделения вируса из патматериала;

– накопления вирусной массы;

– поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;

– титрования вируса;

– получения гипериммунных сывороток;

– в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.

В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.

4.3 Требования к лабораторным животным. Комплектуя группы животных для вирусологических исследований, необходимо выполнять следующие требования:

– животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

– возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных. Например, для биопробы на бешенство и ящур используют мышей-сосунов, на ларинготрахеит птиц – цыплят. Но в то же время заражение взрослых кроликов вирусом болезни Ауески ведет к появлению ярких и специфичных клинических признаков заболевания;

– стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе;

– лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т. е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день). В этот период за животными ведут ежедневное клиническое наблюдение. При подозрении на наличие инфекционной болезни животных подвергают лабораторному исследованию. В случае установления инфекционного заболевания среди животных всю поступившую партию уничтожают.

4.4 Содержание лабораторных животных. Виварий для лабораторных животных должен иметь основное помещение для животных, моечную (с боксом, сушиль­ными и стерилизационными установками), кухню для приготовления корма с одним по крайней мере столом, оборудованным для приготовления корма, и холодильником для скоропортящихся продуктов, кладовую, операционную, гар­дероб и санитарное помещение для обслуживающего персонала. Помещения должны быть чистыми. Стены и полы легко дезинфицируемыми. Запасы корма следует хранить в специальных помещениях. В местах содержания опытных животных желательно иметь гигрометр и термометр.

Мышей, крыс, хомяков и морских свинок в период опыта рекомендуется содержать в стеклянных банках с крышкой из проволочной сетки или перфори­рованного листового железа. Это облегчает наблюдение за ними, а банки легко чистить и дезинфицировать. Можно содержать животных в металлических клет­ках, которые также легко дезинфицировать.

В качестве подстилки применяют материалы, которые адсорбируют влагу и могут быть использованы животными для постройки гнезда: стружку для мы­шей, крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кур; опилки для крупных мы­шей, крыс, хомяков, хорьков, кур; солому для хомяков, морских свинок, кроли­ков, собак, кур; мякину для мышей, крыс; сено для мышей, крыс, хомяков, хорьков, кур; песок для кур. Следует использовать такую подстилку, которая образует как можно меньше пыли, так как последняя может привести к заболева­нию органов дыхания. Любую подстилку необходимо предварительно стерили­зовать при 100 °С в течение 30 мин.

Помещения для лабораторных животных периодически дезинфицируют, осо­бенно перед размещением новой партии животных. Это относится и к предме­там ухода за животными (лопаты, скребки, метелки и др.), которые соприкаса­ются с навозом и различными отбросами из помещения. После окончания каж­дого опыта клетки обязательно обрабатывают дезинфицирующими растворами, чему должна предшествовать чистка как клеток, так и помещения.

Посуду для корма и воды ежедневно смачивают дезинфицирующим раствором, после чего моют и споласкивают чистой водой. Помещения обрабатывают 1% раствором едкого натра, который используют в течение суток. Дезковрики пропитывают свежим раствором каждые 2 дня. Для дезинфекции предме­тов ухода, мытья полов и посуды рекомендуется использовать 3% раствор хлорамина, который должен быть применен в течение 2 ч. В виварии необходи­мо уничтожать вредителей: мух, комаров, блох, власоедов, клещей, вшей, му­равьев, мышей, крыс.

Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам – дневной свет и температура в пределах 16–23, 14–18 и не ниже 0°С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см² дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.

Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезинфицирующих веществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам. Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные. Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

Таблица 1

Масса животных в разном возрасте

Возраст	Масса, г
Морские свинки	Кролики	Мыши
Дней			1,5
		37-55,7*	3,0
		-	4,5
		-
		-
		-
	221-240-250	-
Месяцев
	350-400	167-307	10-11
	-	419-526	16-18
	450-500	612-897	18-19
	650-700	909-1069	20-22
	700-750	1221-1237	-
	-	1931-2017	-

* Масса кроликов зависит от величины помета: первые цифры при помете из 8 кроликов, вторые – при помете из 3 кроликов.

Выписывая из питомника беременных животных, особенно мышей, следует учитывать, что самки первое потомство нередко уничтожают. Поэтому лучше брать животных, беременных 2–3-й раз. Беременных белых мышей и крыс сле­дует брать в виварий не позже чем за 2–3 дня до родов, а кроликов и морских свинок – за 15 – 20 дней. Перемещение животных в более поздние сроки бере­менности приводит к аборту.

Для предупреждения каннибализма и аборта беременных мышей размешают по 2 – 3 в банку, а белых и хлопковых крыс, морских свинок и кроликов – по одной. Клетки для морских свинок должны быть размером 0,3 х 0,5 м. а для кроликов – 0,75 х 1,0 м. Маток, проявляющих каннибализм, надо немедленно удалять из гнезда. На каждую матку (белую мышь, белую крысу) должно приходиться не более 10–12 новорожденных Большая нагрузка способствует канни­бализму. При проведении с молодыми животными длительных опытов (особен­но зимой) в пищу мышей необходимо добавлять витаминизированный рыбий жир, а в рацион хлопковых и белых крыс – молоко и мясо.

Таблица 2

Температура тела, пульс и число дыханий у здоровых животных

Вид животных	Температура, °С	Пульс в 1 мин	Дыхание в 1 мин
Морская свинка	37,9-39,4
Кролик	38,5-39,7
Крыса белая	37,5-39,3	-
Мышь белая	37,0-39,0		-
Собака	37,5-39,0
Кошка	38,0-39,5
Курица	40,0-42,0		-14
Голубь	41,0-43,0	140-200	16-28
Овца	38,0-41,0		12-20
Свинья	38,0-40,0		10-20
Корова	37,5-39,5	40-80	10-30
Лошадь	37,5-38,5	24-44	8-16

 

Таблица 3

Состав крови некоторых лабораторных животных (по В.Н.Никитину)

Вид животных	Гемо­глобин г%	Число эритроци­тов, млн /мл	Число лей­коци­тов	Лейкоцитарная формула
				Базофилы	Эози- нофи- лы	Мие- лоци- ты	Юные	Пало- чко- ядер- ные	Сег-мен-то-ядер-ные	Лим­фоци­ты	Мо­ноци­ты
Собака		6,5		1,0		-	-	3,0	58,0	25,0	7,0
Овца		9,4	8,2	0,6	4,5	-	-	1,2	33,0	57,7	3,0
Кошка		7,0		-	4,0	-	-	6,0	52,0	37,7	2,1
Кролик		5,0		5,0	1,0	-	-	-	30,0	60,0	4,0
Морская свинка		5,0	12,0	0,1	6,0	-	-	0,5	35,0	53,4	5,0
Крыса белая	11О	6,0	15,0	-	2,0	-	-	-	30,0	67,0	1,0
Мышь белая		9,0	13,0	0,5	-	-	-	2,0	36,0	60,0	0,5
Курица		3,5	36,0	3,0	4,0	-	-	0,25	36,0	50,0	6,75
Голубь		4,0	10,4-31,4	2,0	1,5	-	-	-	-	55,5	34,9
Лягушка		0.38	2,4-39,1	23,0	6,0	-		-		44,5	38,3-39,1

Проявлению каннибализма в значительной мере способствуют посторонние запахи, приобретаемые новорожденными в ходе манипулирования с ними экс­периментатора Новорожденных животных следует брать только прокипячен­ным пинцетом Экспериментатор должен работать в перчатках, с которых смы­ты следы антисептика (йода, фенола и др.) Заражать новорожденных животных лучше на весу или на толстом слое стерильной фильтровальной бумаги.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. (табл. 1-3). От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

4.5 Техника безопасности при работе с лабораторными животными. Прежде всего, сотрудники должны быть защищены от естественных инфекционных болезней животных и от воспроизводимых на них экспериментальных инфекций, возбудители которых патогенны для человека.

Наиболее часто встречается среди лабораторных животных такая естественная инфекция, как сальмонеллез. Заразившиеся люди переносят заболевание в гастроинтестинальной или тифоподобной (генерализованной) форме. Опасность для людей представляют также листериоз, псевдотуберкулез, туберкулез, туляремия.

Поскольку многие инфекционные болезни животных протекают в бессимптомной персистирующей форме, животных необходимо периодически обследовать.

Источником инфицирования людей могут служить экспериментально зараженные животные и их эктопаразиты. Профилактика заражения людей от животных проводится с учетом возможного пути передачи данного возбудителя. Состояние здоровья сотрудников лаборатории находится под медицинским контролем с учетом особенностей инфекции, с возбудителем которой работают сотрудники.

При работе в лаборатории с вирусами бешенства, клещевого энцефалита, инфекционного гепатита и некоторыми другими инфекциями сотрудникам делают прививки против этих болезней. В случае необходимости проводят экстренную профилактику специфическим иммуноглобулином или сывороткой реконвалесцентов. Одновременно осуществляют весь комплекс противоэпидемических мероприятий, необходимый при данной инфекционной болезни.

4.6 Метка лабораторных животных. Метка является непременным условием использования животных в эксперименте. На клетке, в которой помещены зараженные животные, укрепляют бирку с надписью, отражающей использованный для заражения вирус (или номер экспертизы исследуемого патологического материала), количество зараженных животных, дату заражения и, если надо, другие сведения.

Для животных разных видов применяют разные способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Бирки надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу – окольцовывают (курам).

При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при непродолжительном сроке его можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах (у кроликов). Морских свинок можно различать по окраске, которую регистрируют в рабочем журнале.

Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдельных пальцев на передних или задних конечностях, каждый из которых соответствует тому или другому порядковому номеру: на передних лапах – единицам, на задних – десяткам. Однако чаще пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей (растворов фуксина, бриллиантовой зелени) удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставятся в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если тело животного мысленно разделить на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных пятен начинают с левого верхнего угла, т. е. лопатки, и это будет соответствовать 1 (рис. 8). Тогда, двигаясь назад, левый бок соответствует 2, а левое бедро – 3, далее затылок – 4, спина – 5, область репицы – 6, правое плечо – 7, правый бок – 8, правое бедро – 9. Используя два цвета красителей, можно дать обозначения одним из них – единиц, другим – десятков.

Рисунок 8. Метка лабораторных животных

14. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Строение куриного эмбриона.

.1 Достоинства и недостатки куриных эмбрионов как биологических объектов. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, так и для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Этот метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов. Практика приме­нения показала ряд преимуществ этого метода перед культивированием вирусов на лабораторных животных. Известно, что белые мыши, которых широко ис­пользуют при вирусологических исследованиях, могут быть спонтанно зараже­ны рядом вирусных инфекций: эктромелией, лимфоцитарным хориоменингитом, энцефалитом Тейлора, вирусной пневмонией, вирусом Сендай и другими, что крайне осложняет работу и нередко приводит к ошибочным выводам при оценке получаемых результатов. Культивирование вирусов на куриных эмбрио­нах в значительной мере устраняет указанные выше трудности. Наряду с этим от куриного эмбриона можно получить значительно большее количество вируса, чем от лабораторных животных. Куриный эмбрион обладает большей жизнеспо­собностью и устойчивостью к разного рода воздействиям, неизбежным при вве­дении исследуемого материала. При известном навыке работы с эмбрионами и соблюдении правил асептики гибель их незначительна. Наибольший отход эмб­рионов бывает при введении материала в амниотическую полость и желточный мешок, но и в этих случаях она не превышает 10–15%, если соблюдены необхо­димые условия инкубирования.

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными: 1)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; 2) важным преимуществом эмбрионов является также их высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясняется недостаточным развитием защитных механизмов; 3) куриные эмбрионы легкодоступный объект в связи с развитием широкой сети птицефабрик и инкубаториев; 4) куриные эмбрионы экономичны, не требуют ухода и кормления.

Основными недостатками являются: 1) невозможность полностью гарантировать стерильность этой живой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержимом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследования; 2) куриные эмбрионы чувствительны не ко всем вирусам.

7.2 Цели использования куриных эмбрионов. Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:

– обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;

– первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

– поддержания вирусов в лаборатории;

– титрования вирусов;

– накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;

– как тест-объект в реакции нейтрализации.

7.3 Требования к куриным эмбрионам. Яйца необходимо получать из благополучных по вирусным болезням хозяйств. В оплодотворенных яйцах даже от клинически здоровых кур могут находиться различные встречающиеся у этих птиц вирусы: ньюкаслской болезни, инфек­ционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, энцефаломиелита, парагриппа-2, полиартрита, оспы, арбовирусы, аденовирусы и др. Присутствие этих вирусов может, с одной стороны, привести к диагностическим ошибкам, а с другой, на основе явления интерференции, – к подавлению размножения виру­са, находящегося в исследуемой пробе. Эмбрионы, не содержащие вируса, но полученные от кур, бессимптомно за­раженных определенными вирусами, также могут быть менее чувствительны или абсолютно нечувствительны к действию данного вируса благодаря наличию специ­фических антител, полученных от матери с желтком. Для удачного выделения вируса необходимо, чтобы куры, эмбрионы которых используют в работе, не были вакцинированы против болезни, возбудителя ко­торой ищут. Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Для обеспечения нормального развития зародышей в оплодотворенных яй­цах в период инкубации необходимо соблюдать определенную температуру и влажность. Развивающиеся эмбрионы переносят перегрев значительно хуже, чем охлаждение. Поэтому кратковременная (в течение нескольких часов) поломка в системе обогрева не приносит большого вреда. При более длительном перерыве необходим подогрев.

Инкубируемые яйца нуждаются в свободном доступе свежего воздуха, кото­рый поступает через отдушины. Они должны быть всегда открытыми. Одно яйцо, как принято считать, расходует 1 л кислорода в день, что неудивительно, если вспомнить о бурном развитии зародыша в течение 21 дня инкубации. Именно поэтому яйца нельзя класть вплотную, а также одно на другое. Для инкубации яиц непригодны обычные термостаты. Лишь в случае крайней необходимости их можно использовать для этих целей, но при этом часто проветривать ипоста­вить внутрь сосуд с водой для обеспечения требуемой влажности.

Заложенные на инкубацию яйца через 3–5 дней просвечивают с помощью специальной настольной или ручной (если яйца не вынимают из лотка инкуба­тора) лампы, чтобы отобрать неоплодотворенные. Наиболее удобны для вирусо­логических работ яйца леггорнов, так как их тонкая белая скорлупа позволяет лучше рассмотреть содержимое. Неоплодотворенные или содержащие погибших зародышей яйца из инкубатора удаляют. Доля оплодотворенных яиц колеблется в значительных пределах в зависимости от многих факторов, в том числе от времени года: весной она самая высокая, зимой самая низкая.

Второй раз зародыши просвечивают в день запланированного заражения. Срок этот зависит от вида вируса, а также пути его введения. На скорлупе обычным (не чернильным) карандашом отмечают место заражения.

7.4 Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 14). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.

Рисунок 14.Схематический разрез куриного эмбриона на 8-й день инкубации: 1 – скорлупа; 2 – подскорлупная оболочка; 3 – хорионаллантоисная оболочка; 4 – аллантоисная полость; 5 – желточный мешок; 6 – белок; 7 – воздушная камера; 8 – тело зародыша; 9 – амниотическая полость

Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцентрично и относительно зародыша как бы по другую сторону продольной оси.

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.

Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона.

Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.

Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на хорионаллантоисную оболочку проводят на 10-12-й день инкубации.

7.5 Подготовка куриных эмбрионов к заражению. Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Рекомендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализовать свои функции после транспортного стресса. Если лаборатория располагает собственным инкубаторием, то снесенные курицей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в течение 10 дней.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур (рис. 15). Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.

Рисунок 15. Овоскопирование куриного эмбриона на 10-е сутки инкубации. Видны тени:

1 – зародыша; 2 – желточного мешка; 3 – кровеносных сосудов ХАО; 4 – воздушной камеры; 5 – белка

Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.

Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3–4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.

В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием.