Отбор, хранение и транспортировка пробы

Тема 1

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И САНИТАРНО
-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБЫ ВОДЫ ИЗ ПРУДА В БОРОВИКАХ

Цели работы:

1. Исследовать физико-химическое и санитарно-микробиологическое состояние пруда в Боровиках города Кирова.

2. Определить следующие показатели пробы воды:

- реакцию среды, окраску, запах пробы воды;

- общее микробное число (ОМЧ);

- общие колиморфные бактерии (ОКБ);

- термотолерантные колиморфные бактерии (ТКБ).

3. Сделать выводы:

- о соответствии полученных данных нормативам качества воды водных объектов;

- об интенсивности процессов самоочищения водоемов.

Оборудование:

- автоклав горизонтальный;

- термостаты электрические с автоматическим регулированием;

- холодильники бытовые, поддерживающие температуру на (4-6)°С;

- микроскоп «Микмед-2»;

- вакуумный насос;

- pH-метр;

- сушильный шкаф с регулированием температуры до 200°С;

- часы песочные на 1 минуту;

- весы лабораторные.

Лабораторная посуда:

- колбы различной емкости (100, 250, 500 и 1000 мл);

- чашки Петри бактериологические;

- шпатели стеклянные и металлические;

- стеклянные градуированные пипетки емкостью 1 и 10 мл;

- пеналы металлические для пипеток;

- стеклянные флаконы;

- стеклянные бактериологические пробирки;

- колба Бунзена для фильтрования под вакуумом;

- цилиндры емкостью 100, 250 и 500 мл;

- стаканы лабораторные;

- стекла предметные для микропрепаратов;

- пробки резиновые и ватно-марлевые;

- ложки пластиковые;

- металлический пинцет;

Реактивы:

- 0,9 % физиологический раствор хлорида натрия;

- сухая питательная среда Эндо промышленного производства;

- сухая питательная среда МПБ промышленного производства;

- агар-агар;

- карболовый раствор генцианвиолета;

- раствор Люголя;

- 96% этиловый спирт;

- раствор фуксина Пфейфера;

- промышленный набор для оксидазного теста;

- бумага фильтровальная.

Ход работы

Отбор, хранение и транспортировка пробы

Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отбирали на глубине 10-15 см от поверхности водоема в стерильные флаконы с резиновой пробкой. Пробу доставили для исследования в течение часа. Флакон с пробой промаркировали.

 

Таблица 1 – условия отбора пробы воды

Дата отбора	13.06.2017
Место отбора	Пруд в Боровиках
Температура воздуха, °С	+18
Ветер, м/с	2, южный
Давление, мм.рт.ст.
Влажность, %
№ подгруппы
ФИО	Ковязина И.С.
Новикова О.А.
Малинина А.И.

 

Рисунок 1 – Пруд в Боровиках

Рисунок 2 – Отобранная проба воды

Определение физико-химических показателей исследуемой пробы воды

Определили запах исследуемой пробы воды при температуре
(15-20)°С. Для этого налили в колбу с широким горлом на 2/3 ее объема исследуемую пробу воды, встряхнули колбу вращательными движениями, втянули носом воздух из колбы. Затем колбу с пробой воды нагрели до 60°С, встряхнули и снова втянули носом воздух из колбы.

Определили показатель рН исследуемой пробы воды на лабораторном рН-метре.

Определение микробиологических показателей исследуемой пробы воды

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе воды

Приготовили ряд последовательных разведений. Для этого в первую пробирку внесли стеклянной градуированной пипеткой 10 мл исследуемой воды из флакона (цельная проба). Объем засеваемой воды выбран с предположением, что водоем загрязнен сточными водами. В другие 4 пробирки внесли по 9 мл 0,9 % физиологического раствора хлорида натрия. Затем в первую пробирку с физиологическим раствором с помощью стеклянной градуированной пипетки внесли 1 мл исследуемой пробы воды, из этой пробирки уже новой пипеткой отобрали 1 мл и внесли в следующую и тд. Последняя пробирка соответствует концентрации 10^-3.

Рисунок 3 – Схема приготовления разведений для определения ОКБ в пробе воды

Затем воду из всех разведений профильтровали с помощью вакуумного насоса. Для этого воронку протерли ватным тампоном, смоченным 96% этиловым спиртом. После высыхания спирта в воронку фильтровального аппарата положили фламбированным пинцетом стерильную фильтровальную бумагу. В воронку прибора для фильтрования наливали разведения, начиная с последнего, и создавали вакуум.

После окончания фильтрования и осушения фильтра отключали вакуум, фильтр осторожно поднимали за край фламбированным пинцетом и переносили его, не переворачивая, на питательную среду Эндо, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Чашки Петри подписали и поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа.

Для учета выбирали фильтры, на которых выросли изолированные типичные для лактозоположительных бактерий колонии: темно-красные, красные, с металлическим блеском и без него, слизистые с темно-малиновым центром с отпечатком на обратной стороне фильтра.

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе воды

Пересеяли колонии с фильтров на чашки Петри со средой Эндо. Для этого разделили дно двух чашек Петри на 5 сегментов и в каждый из них пересеяли штрихом колонии, взятые с фильтров всех разведений. Чашки подписали. Одну из них поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа, другую при температуре 44°С на 24 часа. После инкубации описали колонии, сделали из них мазки и окрасили по Граму.

Провели оксидазный тест. Для этого стеклянной палочкой нанесли на бумажные тест-системы промышленного производства (с уже нанесенным на них реактивом) немного культуры. Реакцию считали положительной, если в течение 1 мин появлялось сине-фиолетовое окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не менялся.

Результаты

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе воды

Колонии выросли на всех чашках, на чашке с цельным разведением сплошной рост (при расчете по формуле не учитывали).

Таблица 4 – Число колоний колиформных бактерий на среде Эндо

№ чашки	Концентрация	Количество колоний
	Цельная проба	Сплошной рост
	0,9
	0,09
	0,009
	0,001

 

(1)

где X – концентрация, [КОЕ/мл]

X (ОКБ) = = 32 КОЕ/мл

 

Рисунок 4 – Цельная проба Рисунок 5 – Концентрация 0,9

Рисунок 6 – Концентрация 0,09 Рисунок 7 – Концентрация 0,009

Рисунок 8 – Концентрация 0,001

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе воды

При температуре 37°С характерные для кишечной палочки малиновые колонии с блеском выросли из цельного разведения и из разведения с концентрацией 10^-3. Из разведений с концентрацией 0,9, 0,09, 0,009 выросли колонии светло-розовые с блеском. Везде сплошной газон.

Таблица 5 – Колонии колиформных бактерий на среде Эндо при 37°С

№ сектора	Концентрация	Цвет колоний	Отношение к лактозе
	Цельная проба	Малиновый	Лактозоположительные
	0,9	Светло-розовый	Лактозоотрицательные
	0,09	Светло-розовый	Лактозоотрицательные
	0,009	Светло-розовый	Лактозоотрицательные
	0,001	Малиновый	Лактозоположительные

 

Рисунок 9 – Посев на среду Эндо при температуре 37°С

1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001

После окраски мазков по Граму из культур, выросших при температуре 37°С обнаружены грамотрицательные короткие палочки во всех разведениях.

 

Препараты окрашены по Граму, объектив 100х

Рисунок 11 – Препарат из концентрации 0,9

Рисунок 10 – препарат из

цельной пробы

Рисунок 13 – Препарат из концентрации 0,009

Рисунок 12 – Препарат из

концентрации 0,09

Рисунок 14 – Препарат из концентрации 0,001

При температуре 44°С характерные для кишечной палочки малиновые колонии с блеском выросли только из концентрации 10^-3. Сплошной рост.

Рисунок 15 – Посев на среду Эндо при температуре 44°С

1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001

После окраски мазков по Граму из культуры, выросшей при температуре 44°С из концентрации 10^-3 обнаружены грамотрицательные длинные палочки.

 

Рисунок 16 – Препарат из концентрации 0,001, окраска по Граму, объектив 100х

 

 

Оксидазный тест дал положительный результат у культуры с концентрацией 0,09, выросшей при температуре 37°С. У остальных культур оксидазный тест отрицательный.

Рисунок 17 – Оксидазный тест

1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001;
6 – концентрация 0,001 (Т = 44°С)

Тема 2

Ход работы

2.1 Отбор пробы и предварительная обработка почвенного образца для анализа

Пробу почвы отбирали вблизи пруда в Боровиках на участке площадью 25 м² в пяти точках по «конверту» (четыре точки по углам и одна в центре). Пробу отбирали стерильным скальпелем в специальный контейнер. Перед доставкой в лабораторию образец хранился при температуре (4-5)°С около 20 часов.

Рисунок 30 – Расположение места отбора пробы почвы на карте

Таблица 9 – условия отбора пробы почвы

Дата отбора	19.06.2017
Место отбора	Боровики
Температура воздуха, °С	+19
Ветер, м/с	2, юго-западный
№ подгруппы
ФИО	Ковязина И.С.
Новикова О.А.
Малинина А.И.

 

Рисунок 31 – Отобранная проба почвы

Для приготовления среднего образца почву всех образцов с участка высыпали на бумагу, тщательно перемешали руками в стерильных перчатках. Убрали камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределили на листе ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву разделили на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников убрали, а оставшуюся вновь перемешали, опять распределили тонким слоем и разделили диагоналями, два противоположных треугольника убрали, а оставшуюся почву вновь перемешали. Из этой почвы приготовили навеску массой 10 г. Керамическую ступку протерли 96% этиловым спиртом, высыпали в нее навеску почвы и растерли в 100 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Затем перелили во флакон. Флакон с пробой поставили в шейкер на 10 минут.

Рисунок 32 – Проба почвы в 100 мл физиологического раствора (1:10)

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе почвы

Приготовили ряд десятикратных разведений. Для этого налили в 3 стерильные пробирки по 4,5 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Из первого разведения, находящегося во флаконе (концентрация 10^-1) отобрали стерильной градуированной пипеткой 0,5 мл и перенесли в первую пробирку (концентрация 10^-2), затем из нее перенесли 0,5 мл во вторую (концентрация 10^-3). Для приготовления каждого разведения использовали стерильные пипетки.

Рисунок 33 – Схема приготовления разведений для определения ОКБ

Посеяли в чашки Петри на среду Эндо из разведений 10^-2, 10^-3, 10^-4 по 0,1 мл суспензий. Чашки подписали, поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа. Учитывали отдельно выросшие колонии красного и малинового цвета. Колонии описали, сделали мазки и окрасили их по Граму.

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе почвы

Произвели пересев колоний, выросших на среде Эндо при температуре 37°С методом штриха также на среду Эндо. Чашку подписали, поставили в термостат при температуре 44°С на 24 часа. Учитывали колонии красного и малинового цвета.

Результаты

Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе почвы

 

Таблица 10 – Число колоний на среде Эндо при температуре 37°С

№ чашки	Концентрация	Количество колоний
	10-2
	10-3
	10-4

 

Для расчета концентрации ОКБ используется формула 1.

X (ОКБ) = = 1801,8 КОЕ/мл

Для пересчета концентрации ОКБ на 1 г сырой почвы:

, (3)

где Nc – количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы, [КОЕ/г];

Nc (ОКБ) = = 18018 КОЕ/г

Для пересчета концентрации ОКБ на 1 г сухой почвы:

, (4)

где:

N – количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы, [КОЕ/г];

Nc – количество клеток бактерий в г сырой почвы, [КОЕ/г];

C – влажность исследуемой почвы, [%].

Навеска влажной почвы имела массу 10 г, после высушивания масса составила 8,2 г, следовательно, влажность исследуемой почвы 18%.

Коли индекс – количество КОЕ/л или КОЕ/г кишечной палочки

Коли индекс = [КОЕ/г] (5)

Коли индекс = = 3,9 КОЕ/г

Коли титр – наименьший объем, в котором содержится единица кишечной палочки.

Коли титр = [КОЕ/г] (6)

Коли титр = = 0,26 КОЕ/г

Рисунок 35 – Концентрация 10^-2 Рисунок 36 – Концентрация 10^-3

Рисунок 37 – Концентрация 10^-4

При температуре 37°С на чашках со средой Эндо выросли колонии двух типов:

1 тип: средние колонии; форма колоний – круглая; профиль колоний – выпуклый; край колоний – гладкий; структура колоний – однородная; консистенция колоний – жидкая; поверхность колоний – влажная, гладкая, блестящая с глянцем; прозрачность колоний – непрозрачные; цвет колоний – розовый. Окраска по Граму выявила мелкие грамотрицательные палочки.

2 тип: крупные колонии; форма колоний – неправильная; профиль колоний – выпуклый; край колоний – волнистый; структура колоний – неоднородная; консистенция колоний – густая, вязкая; поверхность колоний – влажная, гладкая, блестящая с глянцем; прозрачность колоний – непрозрачные; цвет колоний – розовый. Окраска по Граму выявила грамотрицательные кокки.

Рисунок 39 – препарат 2 типа колоний

Рисунок 38 – препарат 1 типа

колоний

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе почвы

При температуре 44°С на среде Эндо колоний не выросло. Это говорит о том, что в образце почвы нет термотолерантных колибактерий. Показатель ТКБ = 0.

Тема 1

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И САНИТАРНО
-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБЫ ВОДЫ ИЗ ПРУДА В БОРОВИКАХ

Цели работы:

1. Исследовать физико-химическое и санитарно-микробиологическое состояние пруда в Боровиках города Кирова.

2. Определить следующие показатели пробы воды:

- реакцию среды, окраску, запах пробы воды;

- общее микробное число (ОМЧ);

- общие колиморфные бактерии (ОКБ);

- термотолерантные колиморфные бактерии (ТКБ).

3. Сделать выводы:

- о соответствии полученных данных нормативам качества воды водных объектов;

- об интенсивности процессов самоочищения водоемов.

Оборудование:

- автоклав горизонтальный;

- термостаты электрические с автоматическим регулированием;

- холодильники бытовые, поддерживающие температуру на (4-6)°С;

- микроскоп «Микмед-2»;

- вакуумный насос;

- pH-метр;

- сушильный шкаф с регулированием температуры до 200°С;

- часы песочные на 1 минуту;

- весы лабораторные.

Лабораторная посуда:

- колбы различной емкости (100, 250, 500 и 1000 мл);

- чашки Петри бактериологические;

- шпатели стеклянные и металлические;

- стеклянные градуированные пипетки емкостью 1 и 10 мл;

- пеналы металлические для пипеток;

- стеклянные флаконы;

- стеклянные бактериологические пробирки;

- колба Бунзена для фильтрования под вакуумом;

- цилиндры емкостью 100, 250 и 500 мл;

- стаканы лабораторные;

- стекла предметные для микропрепаратов;

- пробки резиновые и ватно-марлевые;

- ложки пластиковые;

- металлический пинцет;

Реактивы:

- 0,9 % физиологический раствор хлорида натрия;

- сухая питательная среда Эндо промышленного производства;

- сухая питательная среда МПБ промышленного производства;

- агар-агар;

- карболовый раствор генцианвиолета;

- раствор Люголя;

- 96% этиловый спирт;

- раствор фуксина Пфейфера;

- промышленный набор для оксидазного теста;

- бумага фильтровальная.

Ход работы

Отбор, хранение и транспортировка пробы

Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отбирали на глубине 10-15 см от поверхности водоема в стерильные флаконы с резиновой пробкой. Пробу доставили для исследования в течение часа. Флакон с пробой промаркировали.

 

Таблица 1 – условия отбора пробы воды

Дата отбора	13.06.2017
Место отбора	Пруд в Боровиках
Температура воздуха, °С	+18
Ветер, м/с	2, южный
Давление, мм.рт.ст.
Влажность, %
№ подгруппы
ФИО	Ковязина И.С.
Новикова О.А.
Малинина А.И.

 

Рисунок 1 – Пруд в Боровиках

Рисунок 2 – Отобранная проба воды