Получениебактериальных препаратов

Промышленное производство биопрепаратов бактериального происхождения заключается в глубинном культивировании энтомопатогенных бактерий с целью получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсинов. Промышленные штаммы бактерий должны отвечать следующим требованиям: относиться к определенному серотипу (одному из 12 серотипов и 15 вариантов Δ‑эндотоксина Bacillusthuringiensis Berl.), иметь высокую вирулентность и репродуктивность, среднюю чувствительность к комплексу бактериофагов, обеспечивать высокую эффективность биопрепарата. Технология производства всех бактериальных препаратов на основе В. thuringiensis Berl. включает следующие стадии:

1) выращивание посевного материала в лаборатории и посевном аппарате;

2) культивирование в промышленном ферментере;

3) концентрирование культуральной жидкости;

4) сушка, стандартизация и фасовка готового препарата.

Бактерии для создания препарата выращивают сначала в 3‑литровых колбах (банках) с искусственной питательной средой (ИПС), а затем в посевном аппарате в условиях аэрации (0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин).

Посевной материал должен содержать не менее 1,7х10⁹ спор в 1 мл. В посевной аппарат культура добавляется в количестве 0,05 % от объема питательной среды аппарата. Температура культивирования — 28–30 °С, продолжительность культивирования — 35–40 ч.

Состав искусственной питательной среды в посевном аппарате и промышленном ферментере следующий: кормовые дрожжи (2–3 %), кукурузная мука (1–1,5 %), кашалотовый (рыбий) жир (1 %). При этом культуру доводят до стадии споруляции (образования спор у 90–95 % бактериальных клеток) (рис. 1). Если споры не требуются, то среда составляется из глюкозы технической (0,7 %), кукурузного экстракта (4 %), хлорида натрия (2 %). Состав среды влияет на соотношение спор и кристаллов эндотоксина бактерии в культуральной жидкости.

Процесс культивирования заканчивают при степени споруляции 90–95 % и титре спор в 1 мг не менее 1х10⁹.

Готовую культуральную жидкость перекачивают в стерильный сборник, передают на сепарацию и получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг из 1 м³культуральной жидкости и титром 20х10⁹ спор в 1 г пасты.

Пасту собирают в отдельном сборнике. Отцентрифугированную питательную среду при необходимости используют еще 1–2 раза (многократное повторное использование его невозможно, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, тормозящие развитие бактерий). В дальнейшем фугат используют для производства кормовых дрожжей (цикл производства замкнутый, что важно с точки зрения экономичности и охраны окружающей среды).

Пасту направляют на приготовление стабилизированной пасты или сухого смачивающегося порошка — конечных препаративных форм биопрепарата.

1 — бактериальная клетка в фазе созревания; 2 — спора бактерии; 3 — Δ‑эндотоксин в форме кристаллического включения в бактериальной клетке

Рисунок 1 — Энтомопатогенная бактерия Bacillusthuringiensis Berl.

Для получения смачивающегося порошка пасту высушивают на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 %, смешивают с каолином до стандарта — 30х10⁹ спор в 1 г препарата. Порошок фасуют в 4‑слойные герметичные мешки по 20 кг.

Стабилизированную пасту готовят, смешивая ее после сепарации с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ). Молекулы КМЦ, имеющие положительный заряд, за счет электростатических сил собирают на себе кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала во всем объеме пасты. Добавляют также консерванты, распределяющиеся равномерно между частицами (рис. 2).

1 — хранение маточного материала; 2 — выращивание посевного материала в лаборатории в качалочных колбах; 3 — выращивание маточной культуры в посевном аппарате; 4 — культивирование в промышленном ферментере; 5 — контроль на наличие свободного фага; 6 — определение степени споруляции; 7 — концентрирование культуры; 8 — повторное использование фугата (питательной среды); 9 — получение пасты; 10 — изготовление стабилизированной пасты; 11 — изготовление сухого или смачивающегося порошка

Рисунок 2 — Блок‑схема производства бактериальных препаратов

Паста не подвержена гниению и брожению, не замерзает при хранении, ей не опасно увлажнение. Это вязкая жидкость кремового цвета без запаха. Производство стабилизированной пасты экономически более выгодно. В препарат можно вводить добавки: антииспарители, смачиватели, прилипатели, приманочные вещества (аттрактанты), а также вещества, защищающие бактерий от влияния солнечной радиации. Применяются бактериальные биопрепараты (лепидоцид, дедробациллин, энтобактерин, дипел, БИП и другие) на овощных культурах с нормой расхода 1–3 кг/га, на древесных культурах с нормой 3–5 кг/га против листогрызущих вредителей (гусениц чешуекрылых, ложногусениц пилильщиков, личинок жуков‑листоедов и др.). Гибель вредителей наступает на 2‑10‑й день.