Работа №2. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА и РПГА синонимы)

Цель: Разобрать механизм, освоить метод постановки РПГА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.

Самостоятельная работа. Учесть результат РПГА с эритроцитарнымсальмонеллезнымдиагностикумом для определения специфических АТ в парных сыворотках больного

 

Направление:

 

Ингредиенты:

 

1)

 

2)

 

3)

 

Механизм:

 

 

Постановка:

1 неделя

 

 

 

1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 КС КД

2 неделя

 

 

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Выполните задания для самоконтроля:

Ингредиенты для постановки РПГА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции_____________________________________________________________

 

Работа № 3. Реакция преципитации (РП)

 

Цель: Разобрать механизм, освоить метод постановки РП в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.

Самостоятельная работа. Поставить РП для выявления сибиреязвенного Аг в экстракте из шерсти животного. Оценить результат, сделать вывод.

Направление:

Ингредиенты:

 

1)

 

2)

 

3)

Механизм:

 

 

Постановка:

 

 

Постановка:

 

 

 

«К» «О»

 

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Самостоятельная работа. Разобрать принцип постановки РП в геле. Сделать вывод.

 

Направление:

 

Ингредиенты:

 

1)

 

2)

 

3)

 

Механизм (см. выше)

 

Постановка:

 

 

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Выполните задания для самоконтроля:

Реакцию преципитации ставят в том случае, если____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки РП:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции____________________________________________________________

Теоретическая справка

Работа № 1

Реакция агглютинации (РА)

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген- взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

 

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Методы постановки РА

 

 

 

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция коагглютинации

Развернутая РА на стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

«О» «К»

 

 

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.

 

Ингредиенты	номер пробирки
						контроль сыворотки	контроль диагности-кума
Физиологический	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
раствор
Сыворотка больного в	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
разведении 1:50
Диагностикум (капли)						-
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:100	-

Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

 

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

++ осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции

Работа № 2

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РПГА, РНГА)

 

Методы постановки РНГА

 

РНГА с эритроцитарным антигенным диагностикумом

Реакция латекс-агглютинации

РНГА с унитиолом (выявление IgM и IgG)

Реакция Кумбса

РНГА с эритроцитарнымантительнымдиагностикумом

 

 

В этой реакции микробный или растворимый антиген адсорбируется на поверхности эритроцитов, которые в таком «нагруженном» состоянии приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для микробного антигена. Учитывается реакция по образованию агглютинированными эритроцитами осадка в виде зонтика на дне планшетов, в то время как в контроле, без иммунной сыворотки, они оседают в центре, образуя пуговку с ровными краями. Реакция гемагглютинации является более чувствительной, чем агглютинация бактерий, применяется для диагностики при многих инфекционных заболеваниях, особенно у детей, при необходимости выявления антител в более низких титрах. Эта реакция может быть использована и для обнаружения антигенов при применении специфических сывороток