Определение массовой доли белка

Определение массовой доли белка в молоке методом формольного

титрования

Принцип метода. Метод заключается в блокировке NH₂ (амино)- групп белков молока внесенным формалином с образованием метилпроизводных белков, карбоксильные группы (СООН) которых могут быть нейтрализованы щелочью. Количество щелочи, пошедшее на титрование кислых карбоксильных групп, пересчитывают на массовую долю белков.

Приборы. Коническая колба вместимостью 100 см³; пипетка вместимостью 20 см³; бюретка вместимостью 25 см³; прибор для автоматического отмеривания формалина вместимостью 1 см³.

Материалы и реактивы. Молоко сырое кислотностью менее 22 °Т; 0,1 н раствор гидроксида натрия; 1%-й спиртовой раствор фенолфталеина; 40%-й раствор нейтрализованного формалина; эталон окраски молока.

Последовательность определения. В химический стакан емкостью 150-200 см³ отмеривают пипетками 20 см³ молока, 0,25 см³ (10-12 капель) 1%-го раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором гидроксида натрия до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 см³ нейтрализованного (свежеприготовленного) 40 %-го формалина и вторично титруют до такой же интенсивности окраски, как и при первом титровании.

Количество миллилитров 0,1 н раствора гидроксида натрия, израсходованное на титрование в присутствии формалина, умноженное на коэффициент 0,959, дает массовую долю общего белка в молоке в процентах.

Для приготовления контрольного эталона окраски в такой же стакан отмеривают 20 см³ молока и 0,5 см³ 2,5 %-го раствора сульфата кобальта. Эталон годен в течение одного занятия.

Для перевода количества раствора гидроксида натрия в проценты белка можно пользоваться таблицей 1, приведенной в Инструкции по технохимическому контролю на предприятиях молочной промышленности (табл.4).

Таблица 4

Зависимость массовой доли белков от объема раствора щелочи, затраченного на титрование проб молока в присутствии формалина

Расход 0,1 н раствора NaOH, см3	Массовая доля общего белка в молоке, %	Расход 0,1 н раствора NaOH, cм3	Массовая доля общего белка в молоке, %
2,45 2,50 2,55 2,60 2,65 2,70 2,75 2,80 2,85 2,90 2,95 3,00 3,05 3,10 3,15 3,20 3,25	2,35 2,40 2,44 2,49 2,54 2,59 2,64 2,69 2,73 2,78 2,83 2,88 2,93 2,98 3,03 3,07 3,12	3,30 3,35 3,40 3,45 3,50 3,55 3,60 3,65 3,70 3,75 3,80 3,85 3,90 3,95 4,00 4,05 4,10	3,16 3,21 3,25 3,31 3,35 3,40 3,45 3,50 3,55 3,60 3,65 3,69 3,74 3,79 3,84 3,89 3,94

 

Колориметрический метод определения массовой доли общего белка

в молоке

Принцип метода. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители (сине-черный, амидо-черный), образуя с ними нерастворимый комплекс. После удаления осадка измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка. Измерение оптической плотности проводят с помощью фотоэлектроколориметров или спектрофотометров.

Определение массовой доли белка рефрактометрическим методом

Принцип метода. Метод основан на измерении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

 

Определение общего белка в молоке методом Кьельдаля

(Арбитражный метод)

Метод определения азота в белоксодержащих продуктах был предложен Кьельдалем в 1883 г. и до сих пор, с небольшими изменениями, является основным методом определения белковых веществ в молоке и молочных продуктах.

Принцип метода.

Метод основан на том, что органические вещества при нагревании с концентрированной серной кислотой окисляются до воды и диоксида водорода, а азот белков и небелковых азотистых соединений переходит в сульфат аммония. При этом серная кислота при нагревании разлагается на диоксид серы, атомарный кислород и воду.

Выделяющийся атомарный кислород окисляет белки, небелковые азотистые соединения и свободные аминокислоты. В результате окисления аминный азот этих соединений будет находиться в форме сульфата аммония. Полученный раствор разбавляют водой, добавляют раствор гидроксида натрия, который нейтрализует свободную серную кислоту и создает щелочную реакцию, благодаря чему из сульфата аммония выделяется аммиак.

Образующийся аммиак перегоняют (дистиллируют) в приемную колбу с борной кислотой, в результате чего получается борат аммония, который в водной среде сильно гидролизован и имеет щелочную реакцию. Для его нейтрализации используют соляную кислоту. По объему (см³) 0,1 н раствора хлористо-водородной кислоты, пошедшей на титрование бората, находят количество азота. Для определения количества общего белка количество азота умножают на коэффициент 6,38, который установлен из расчета, что количество азота, в молочных белках равно 15,65 % и, следовательно, коэффициент равен:

------- = 6,38.

15,65

Приборы. Весы с точностью измерения 0,001 г; электрическая плитка.

Материалы и реактивы. Молоко; мерная колба вместимостью 50 см³; пипетки градуированные на 1 см³, 5 см³; 20 см³; бюксы с крышкой; колба Кьельдаля; делительная воронка; грушеобразная стеклянная пробка; холодильник; градуированный цилиндр на 100 см³; стеклянные бусинки или кусочки фарфора; сульфат калия; сульфат меди; борная кислота; соляная кислота, гидроксид натрия.

Последовательность определения. В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, около 10 г сернокислого калия, 0,5 г окиси ртути или 0,04 г сульфата меди. В бюксу с крышкой отмеривают 5 см³ молока, бюксу закрывают крышкой и взвешивают с точностью до 0,001 г. Навеску молока осторожно переносят в колбу Кьельдаля. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см³ серной кислоты, вливая осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают ее содержимое.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45^о и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратиться пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем проводят более интенсивное нагревание. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при использовании в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при использовании в качестве катализатора сульфата меди). После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 ч, после чего колбе дают остыть до комнатной температуры, добавляют 150 см³ дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты, добавляют 4 капли индикатора и перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником при помощи аллонжа и резиновой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты. Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с длительной воронкой.

Градуированным цилиндром отмеривают 80 см³ раствора гидроксида натрия (при использовании в качестве катализатора красной окиси ртути применяют раствор гидроксида натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (или капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора во избежание потери образующего аммиака закрывают кран делительной воронки.

Содержимое колбы Кьельдаля осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Перегонку продолжают до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без изменения. При перегонке не допускают нагревание раствора борной кислоты в конической колбе. Слишком сильное охлаждение (ниже +10 ^оС) также нежелательно, так как оно может вызывать переброс жидкости из конической колбы в колбу Кьельдаля. Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин. Прекращают нагревание и отсоединяют аллонж. Небольшим количеством дистиллированной воды смывают внешнюю и внутреннюю поверхность аллонжа в коническую колбу.

Титруют дистиллят 0,1 н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фиолетовый.

Параллельно проводят контрольный анализ так же, как и основной, используя вместо молока 5 см³ дистиллированной воды. Контрольный анализ проводится в каждой серии определений количества белка и при каждой замене реактивов.

Массовую долю общего белка (Б) в процентах вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле:

1,4×0,1×К (V₁-V₀) ×6,38

Б = -----------------------------,

M

где 1,4 – количество азота, эквивалентное 1 см³ 0,1 н раствора соляной кислоты, мг;

0,1 –нормальность раствора соляной кислоты;

К – коэффициент поправки к раствору соляной кислоты;

V₁ – объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование

дистиллята в основном анализе, см³;

V₀ – объем 0,1 н соляной кислоты, израсходованной на титрование

дистиллята в контрольном анализе, см³;

6,38 – коэффициент для пересчета массовой доли общего азота в

массовую долю общего белка;

m – масса молока, взятого на анализ, г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ МАСТИТНОГО МОЛОКА

Для контроля примеси маститного молока в сборном применяют различные методы, основанные на определении количества в молоке соматических клеток (лейкоцитов и др.), его физико-химических свойств и др. Чаще используют методы определения в молоке числа соматических клеток – косвенным путем или методом их прямого подсчета.

При определении соматических клеток применяют специальные препараты – «Мастоприм», «Мастидин» и др. Определение осуществляют по ГОСТ 23453.

Визуальный метод

Принцип метода. Метод основан на взаимодействии препарата «Мастоприм» с соматическими клетками исследуемого молока, в результате которого меняется его консистенция (вязкость).

Приборы. Молочно-контрольные пластинки ПМК-1, пипетки вместимостью 1 см³; секундомер; стеклянная или пластмассовая палочка.

Материалы и реактивы. Пробы молока с различным количеством соматических клеток; 2,5%-й раствор препарата «Мастоприм».

Последовательность определения. В лунку пластинки вносят пипеткой 1 см³ молока и 1 см³ препарата «Мастоприм». Молоко с препаратом интенсивно перемешивают палочкой в течение 10 с. Полученную смесь из луночки пластинки при непрерывном интенсивном перемешивании поднимают палочкой вверх на 5-7 см, после чего в течение не более 60 с оценивают результаты анализа.

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по консистенции молока в соответствии с требованиями, изложенными в табл 5.

Таблица 5

Характеристика консистенции молока с препаратом «Мастоприм»	Количество соматических клеток в 1 см3 молока
Однородная жидкость или слабый сгусток, который слегка тянется за палочкой в виде нити.	До 500 тыс.
Выраженный сгусток, при перемешивании которого хорошо видна выемка на дне луночки пластинки. Сгусток не выбрасывается из луночки.	От 500 тыс до 1 млн
Плотный сгусток, который выбрасывается палочкой из луночки пластинки.	Свыше 1 млн

К недостаткам метода можно отнести субъективное определение характера консистенции смеси молока с препаратом «Мастоприм», особенно при наличии в молоке небольшого количества соматических клеток.

Для устранения недостатков данного метода создан капиллярный вискозиметр «Соматос».

Определение бактериальной обсемененности

Редуктаза

А. Метод с метиленовым голубым

Принцип метода. Метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы. Редуктазник; штатив с пробирками; пипетки градуированные вместимостью 1; 20 см³;

Материалы и реактивы. Молоко сырое; рабочий раствор метиленового голубого.

Последовательность определения. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора метиленового голубого и по 20 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного перевертывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 + 1) ^оС.

Вода в редуктазнике после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру воды поддерживают в течение всего времени определения (37 + 1) ^оС. Для предотвращения влияния света редуктазник плотно закрывают крышкой. Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 40 мин, 2,5 и 3,5 ч с начала проведения анализа. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока. При этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху (шириной не более 1 см) или небольшую окрашенную часть внизу пробирки (шириной не более 1 см) в расчет не принимают. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов, указанных в табл 6.

Таблица 6

Класс молока	Продолжительность обесцве-чивания, ч	Ориентировочное количество бактерий в 1 см3 молока, КОЕ
Высший	Более 3,5	До 300 тыс.
I	3,5	От 300 тыс. до 500 тыс.
II	2,5	От 500 тыс. до 4 млн.
III	40 мин	От 4 млн. до 20 млн.

Б. Метод с резазурином

Принцип метода. Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы. Редуктазник; штатив с пробирками; пипетки градуированные вместимостью 1; 10 см³.

Материалы и реактивы. Молоко сырое; рабочий раствор резазурина.

Последовательность определения. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного перевертывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 + 1) ^оС.

Вода в редуктазнике после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей.

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 20 мин и 1 ч. После снятия показаний через 20 мин пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. По истечении 1 ч. оставшиеся пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов, указанных в табл 7.

Таблица 7

Класс молока	Время обесцве-чивания или изменения окраски, ч	Ориентировочное количество бактерий в 1 см3 молока, КОЕ	Окраска молока
Высший	1,5	До 300 тыс.	От серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком
I		От 300 тыс. до 500 тыс.	То же
II		От 500 тыс. до 4 млн.	Сиреневая с розовым оттенком или ярко-розовая
III		От 4 млн. до 20 млн.	Бледно-розовая или белая

Фосфатаза

Фосфатаза относится к группе ферментов, катализирующих расщепление и синтез сложных эфиров фосфорной кислоты. Фосфатаза не устойчива к нагреванию, поэтому реакцию на фосфатазу в молоке и молочных продуктах производят с целью контроля пастеризации молока. Фосфатаза обладает большей чувствительностью к нагреванию по сравнению с пероксидазой, она инактивируется при температуре пастеризации молока ниже 80 ^оС.