Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулинявляется регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков. В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

− недостаток поголовья скота;

− сложности хранения и транспортировки сырья;

− трудности выделения и очистки гормона;

− возможность развития аллергических реакций.

Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами. Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей

1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С- пептида.

При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

В отличие от инсулина аминокислотная последовательность с-пептида сильно отличается у разных видов млекопитающих, что делает невозможным получение его из животного сырья. Существующие способы получения с-пептида, можно разделить на три категории:

1) Получение с-пептида химическим синтезом. Этим способом получено большинство препарата, представленного на рынке в настоящее время.

2) Получение с-пептида биосинтетическими методами в составе слитых белков. Для получения с-пептида этим способом создается химерный белок, в котором за лидерным фрагментом следуют несколько последовательностей с-пептида, разделенных аминокислотами, обеспечивающих гидролиз специфическими протеазами. На первом этапе происходит культивирование микроорганизмов в ферментерах, затем в них индуцируется синтез рекомбинантного полипептида; клетки разрушаются, и рекомбинантный белок очищается и обрабатывается специфическими протеазами, приводящими к получению с-пептида. На заключительном этапе происходит очистка с-пептида от примесей. Данный способ может обеспечить большие объемы производства, но требует создания штаммов-продуцентов, отработки условий культивирования микроорганизмов, способов очистки рекомбинантного белка, а также создания и валидации методов контроля качества.

3) Получение с-пептида биосинтетическими методами совместно с инсулином. Этот способ производства заключается во введении некоторых модификаций в технологию получения рекомбинантного инсулина с целью оптимизации получения с-пептида, образующегося на определенных этапах производства, в основе которого лежит получение проинсулина, не подвергающегося модификациям. Данный способ имеет ряд преимуществ. Для получения с-пептида этим способом не требуется создания новых штаммов-продуцентов, отработки технологии очистки и сворачивания белка, создания новых инструментальных методов контроля производственного процесса.