Организация иммунной системы. Антигены

Занятие №1

Организация иммунной системы. Антигены

Иммунологическая лаборатория, объекты и этапы исследования

Определение лейкоцитарной формулы

 

Вопросы для подготовки

1. Предмет и задачи иммунологии. История становления и развития иммунологии как науки.

2. Иммунная система. Общее понятие и определение. Центральные и периферические органы иммунной системы.

3. Определение понятия «Иммунитет» и «Иммунный ответ». Классификация видов и форм иммунитета, их общая характеристика

4. Генез (развитие и дифференцировка) лимфоцитов и их значение в формировании клеточного и гуморального иммунитета. Предшественники Т- и В-лимфоцитов. Рециркуляция лимфоцитов.

5. Антигены, определение, химическая природа, строение и свойства.

6. Классификация антигенов. Тимусзависимые и тимуснезависимые антигены.

7. Антигенная структура микроорганизмов.

8. Структура лаборатории клинической иммунологии. Задачи. Техническая оснащенность. Автоматизация.

9. Основы техники безопасности. Санэпидрежим. Дезинфицирующие средства. Правила работы с дезинфицирующими средствами.

10. Этапы лабораторных иммунологических исследований: преаналитический, аналитический, постаналитический. Задачи этапов, характеристика возможных ошибок.

11. Виды биоматериала, поступающего на исследование. Техника обработки, получение проб, условия хранения проб.

12. Подпишите органы иммунной системы к которым направлены указатели.

13. Схематично зарисуйте антигенную структуру бактерий, обозначьте на рисунке все антигены.

 

Практическая работа

З а д а н и е №1

Провести определение лейкоцитраной формулы своей крови. Оформить протокол в виде рисунка. Сделать заключение.

 

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Для установления лейкоцитарной формулы крови человека или лабораторных животных необходимо правильно приготовить мазки крови, которые получают следующим образом. На середину хорошо вымытого и обезжиренного предметного стекла без царапин наносят каплю исследуемой крови величиной с «просяное зерно». Затем делают мазок при помощи другого шлифованного предметного или покровного стекла более узкого, чем основное предметное стекло. При этом узкое стекло прикладывают к основному стеклу под углом 45°. Дают капле крови растечься по краю шлифа и быстро продвигают его к противоположному концу стекла. Мазки крови должны быть равномерными и тонкими и не доходить до края предметного стекла. Мазки крови сушат на воздухе, а затем фиксируют в закрытой кювете химически чистым этиловым спиртом в течение5 минут. Зафиксированные мазки окрашивают в течение 20 минут по методике Романовского-Гимза. В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. После окраски препараты крови промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе. Плохое приготовление мазка приводит к не равномерному распределению

Лейкоцитов и дает при подсчете не правильное соотношение их отдельных популяций. В толстом мазке форменные элементы крови трудноразличимы. Подсчет лейкоцитарной формулы крови осуществляют с помощью светового микроскопа при иммерсионном увеличении объектива×90 (или при увеличении объектива×20 иокуляре×10). Начинают подсчет клеток крови с середины окрашенного мазка, передвигая предметное стекло зигзагообразно от центра к краю по всей поверхности мазка (зубчатая линия Меандра). Более крупные по величине клетки крови располагаются по краям препарата. Считают подряд все встречающиеся в поле зрения форменные элементы (всего200 клеток), распределяя их в отдельные популяции с учетом величины клеток, формы и окраски ядра и цитоплазмы. Определяют процентное содержание клеток различных популяций в исследуемом образце. Сравнивают полученную лейкоцитарную формулу анализируемой крови с представленными в табл. 2 приложения данными о количественном содержании отдельных популяций клеток в крови людей разного возраста.

 

Справочный материал для оформления протоколов

 

Таблица Лейкоцитарная формула крови

Показатель	Среднее значение М±т у людей в возрасте
Лейкоциты, 109/л   Лимфоциты, %   Лимфоциты, 10 /л	18–25 лет   6,53±0,025 (3,23 – 9,60)   30,8±1,07 18–48   2,02±0,15 (0,85–4,19)	27–55 лет   5,60+0,21 (3,12–9,50)   29,4+1,11 17–46   1,65±0,11 0,72–4,10	60–80 лет   4,90±0,26 (2,65–8,60)   27,1±1,00 16–44   1,33+0,12 0,60–3,50
Моноциты, %	6,50±0,27 (2–10)	6,20±0,24 (2–10)	5,90±0,25 (1–10)
Нейтрофилы Палочкоядерные   Сегментоядерные   Эозинофилы, %	1,80+0,02 1–5   58,2+1,13 (40–72)   2,30±0,03 (1–5)	1,56±0,02 1–5   60,30+1,118 43–73   2,20±0,03 1–5	1,60±0,02 1–5   62,60±1,15 43–75     2,4+0,03 1–5
Базофилы, %	0,40±0,003 0–1	0,40+0,003 0–1	0,40±0,003 0–1
Т–лимфоциты, %   Т–лимфоциты,109/л   В–лимфоциты, %	63,7± 1,3 5 39–81   1,28+0,11 0,58–3,25   9,6±0,78 3–26	67,3±1,21 40–84   1,11±0,10 0,40–3,12   8,20±0,88 2–25	71,2±1,30 38–85   0,95±0Д0 0,33–2,80   8,50+0,85 2–31
В–лимфоциты, 109/л	0,19+0,10 0,3–3,5	0,14±0,01 0,02–0,98	ОД 1+0,01 0,2–0,92

 

Занятие №2

З а д а н и е №1

Определить фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови (фагоцитарный показатель – ФП и фагоцитарное число – ФЧ). Оформить протокол в виде рисунка. Сделать заключение.

 

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

В центрифужную пробирку с 0,25 мл 2 %-ного цитрата натрия вносят 0,5 мл исследуемой цельной капиллярной или венозной крови, взятой натощак, добавляют 0,25 мл 2 млрд взвеси суточной микробной культуры (S. aureus 209Р или Е. coli Гусев), предварительно подогретой до 37 ºС. Лейкоцитарно-микробную смесь инкубируют при 37°С в течение 40 мин при постоянном перемешивании. Из полученной взвеси готовят 2 тонких мазка, высушивают при комнатной температуре, фиксируют в смеси Никифорова 5-10 мин и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Готовые окрашенные мазки микроскопируют с иммерсией. В разных полях зрения находят не менее 25 лейкоцитов и считают количество микробов, поглощенное каждым лейкоцитом. Для характеристики фагоцитарной активности крови подсчитывают ФП и ФЧ.

ФП – это процент активно фагоцитирующих лейкоцитов в расчете на 100 лейкоцитов.

ФЧ – среднее количество микробов, поглощенных одним фагоцитом (для этого общее число поглощенных микробов делят на количество подсчитанных клеток – 25).

Для лейкоцитов крови здоровых людей ФП колеблется от 40 до 80%, ФЧ – от 4 до 10.

 

З а д а н и е №2

Изучить незавершенный фагоцитоз гонококка. Микроскопировать с иммерсией и объективом ´90 фиксированный препарат, приготовленный из гнойного отделяемого больного гонореей, окраска по Граму. Оформить протокол в виде рисунка с обозначениями. Ответить на вопросы:

1. Какой метод исследования применен?

2. В чем причина незавершенного фагоцитоза гонококков?

 

Занятие №3

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

На поверхность кожи предплечья (ладонная сторона) наносят пипеткой 1 каплю культуры E. coli. Распределяют суспензию стерильным стеклянным шпателем. Делают первый отпечаток с кожи пластинкой со средой Эндо (0 мин экспозиции). Через 10 мин экспозиции контакта микробов и кожи делают второй отпечаток (рядом с первым, но не с того же участка). Чашки с предметными стеклами-отпечатками помещают в термостат на 24 часа. Подсчитывают количество колоний на пластинках со средой Эндо. На основании полученных результатов рассчитывают индексы бактерицидности (ИБ) по формуле:

ИБ = (К_о – К₂₀)/К_о 100%,

где К_о – количество колоний сразу после контаминации кожи;

К₁₀ – количество колоний через 10 мин после контаминации кожи.

В норме ИБ > 95%.

 

З а д а н и е №2

Определить активность (титр) лизоцима в собственной слюне. Учесть полученные результаты и данные занести в таблицу. Оформить протокол. Сделать заключение.

Ответить на вопросы:

1. Почему в качестве объекта использован Micrococcus luteus?

2. Зачем поставлен контроль культуры?

3. Что такое титр лизоцима в слюне?

 

Разведения слюны/ Ингредиенты	1: 20	1: 40	1: 60	1: 80	1: 160	1: 320	1: 640	Контроль
Слюна 1: 10, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	–
Физ.раствор, мл	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	2,0
2-х млрд. взвесь M. luteus, капли
Инкубация 20 мин, 37°С
Результат

в дез. раствор

«+» – лизис культуры, «–» – отсутствие лизиса

 

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

В пробирках готовят разведения слюны, начиная от 1:10 и заканчивая 1:640. В контрольную пробирку вместо слюны добавляют физиологический раствор. К каждому разведению добавляют 2-х млрд. взвесь микрококка (M. luteus) по 5 капель. Ставят в термостат на 20 мин. Определяют титр лизоцима по наличию просветления в среде (полный лизис микрококка). В норме титр лизоцима > 1:320.

 

 

Занятие №4

Цитокины

З а д а н и е №3

Определить титр комплемента в сыворотках морской свинки и человека по реакции иммунного гемолиза. Учесть полученные результаты и данные занести в таблицу. Оформить протокол. Сделать заключение.

 

Сыворотка человека, мл	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1	К
Физ. раствор, мл	0,5	0,6	0,7		0,9	?
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	?
Инкубация 45 мин, 37°С
Результат
Сыворотка морской свинки, мл	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1	?
Физ. раствор, мл	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	?
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	?
Инкубация 45 мин, 37°С
Результат

«+» – гемолиз (лаковая кровь), «–» – отсутствие гемолиза

 

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Сыворотки морской свинки и человека последовательно разводят физиологическим раствором (как указано в таблице). К каждому разведению сыворотки добавляют 3%-ную взвесь эритроцитов барана и инактивированную гемолитическую сыворотку (гемолитическая система). Пробирки ставят в термостат на 45 мин при 37°С. Учет производят по наличию полного гемолиза. Сыворотка человека используется неразведенная, а сыворотка морской свинки предварительно разводится в 10 раз.

Титром комплемента называется его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз.

 

 

Занятие №5

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Три порции расплавленного 3%-ного агара смешивают в соотношении 1:1 соответственно с антиглобулиновыми сыворотками против IgM, IgG и IgА. Этими смесями покрывают три стеклянные пластины. В застывшем агаре каждой пластины делают лунки, в которые вносят по 0,2 мкл стандартной сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов трех классов (М, G и А): неразведенной, и в разведениях 1:2, 1:4, 1:6 и 1:8. В другие лунки каждой пластины вносят испытуемые сыворотки, взятые от обследуемых людей, в которых хотят определить содержание IgM, IgG и IgА. После суточного выдерживания во влажной камере при 4°С измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации с разведениями стандартной сыворотки на каждой из трех пластин и строят калибровочные кривые, отражающие концентрацию IgM, IgG и IgА в этой сыворотке (d_зоны= f (СIg)). Затем измеряют диаметры колец с исследуемой сывороткой (на трех пластинах) и по калибровочным кривым определяют концентрацию IgM, IgG и IgА в сыворотках обследуемых.

Исходный уровень содержания иммуноглобулинов в стандартной сыворотке:

IgG – 8,41 мг/мл (133 МЕ/мл)

IgM – 1,12 мг/мл (109 МЕ/мл)

IgA – 1,55 мг/мл (104 МЕ/мл)

 

З а д а н и е №2

Используя готовые демонстрации познакомиться с методикой проведения HLA-типирования. Оформить протокол в виде рисунка. Ответить на вопросы:

1. Как получают сыворотки для HLA-типирования?

2. Как защитить содержимое лунок от высыхания в процессе постановки реакции?

3. Когда и с какой целью проводят HLA-типирование?

 

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Суспензию лимфоцитов смешивают с антисывороткой к определенному антигену (HLA-В8, HLA-B27 и т.д.), инкубируют 1 час при 25°С, добавляют комплемент и инкубируют вновь 2 ч при 37°С, а затем добавляют трипановый синий или эозин. В случае присутствия в лимфоцитах антигена, соответствующего антителам, содержащимся в сыворотке, антитела в присутствии комплемента повреждают мембрану лейкоцитов, краска проникает в их цитоплазму и они окрашиваются в синий или же красный цвет (если используется эозин).

 

 

 

Занятие №1

Организация иммунной системы. Антигены