Тесты скриниговой коагулограммы.

К тестам скриниговой коагулограммы относятся протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ) и фибриноген. ПВ выявляет нарушения внешнего пути свертывания, АЧТВ – внутреннего пути свертывания, ТВ – конечного этапа свертывания, то есть образования фибрина из фибриногена. При проведении тестов время свертывания плазмы пациента сравнивается со временем свертывания плазмы здоровых доноров. Укорочение времени свертывания указывает на гиперкоагуляцию, удлинение – на гипокоагуляцию. Удлинение времени свертывания во всех трех тестах одновременно встречается при гепаринотерапии, присутствии в пробе продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ) или патологических ингибиторов. Эти тесты являются базисными, так как позволяют решить, какой уточняющий тест необходимо выполнить.

 

Протромбиновое время (ПВ).

ПВ (ПТ) является тестом на внешний (быстрый) механизм гемокоагуляции. В свертывании крови по внешнему пути участвует тканевой фактор (ТФ), он же тканевой тромбопластин, который запускает реакцию свертывания плазмы, витамин К- и одновременно Са⁺⁺-зависимые факторы VII, Х и II (протромбин), фактор V и фактор I (фибриноген). В физиологических условиях ТФ попадает в кровь из поврежденных или разрушенных клеток, в том числе лейкоцитов, макрофагов, клеток опухолей и тканей, и активирует процесс свертывания крови.

Основные области применения: как скриниговый тест исследования свертывающей системы крови, контроль гемостаза при лечении антикоагулянтами непрямого действия (АНД), оценка синтеза в печени факторов протромбинового комплекса.

Принцип метода состоит в определении времени свёртывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы после добавления тканевого фактора и Ca⁺⁺. В качестве тканевого фактора используется тканевой тромбопластин. Тканевые тромбопластины – это водные экстракты липопротеинов тканей млекопитающих, богатые тканевым фактором. Фосфолипиды входят в состав тканевого тромбопластина. Реактивы отличаются активностью, чувствительностью и растворимостью. Для получения воспроизводимых результатов предпочтительно пользоваться готовыми наборами реактивов. ПВ является фосфолипидзависимым тестом.

ПВ может выражаться несколькими способами:

1. Время свертывания в сек.

2. Протромбиновый индекс (ПИ, ПТИ)

Время свертывания нормальной плазмы

ПТИ = ---------------------------------------------------------- х 100%

Время свертывания плазмы пациента

 

3. Протромбиновое отношение (ПО)

Время свертывания плазмы пациента

ПТИ = ----------------------------------------------------------

Время свертывания нормальной плазмы

4. Протромбин по Квику в %. Определяется по калибровочному графику.

5. МНО (Международное Нормализованное Отношение), которое представляет ПО, возведенное в степень Международного Индекса Чувствительности (МИЧ).

МНО = ПО^МИЧ

Время свертывания в сек, ПТИ и ПО – качественные показатели. Время свертывания в сек не определяют из-за низкой воспроизводимости результатов при смене реагентов, ПО используется как промежуточный показатель при определении МНО, а ПТИ имеет низкую информативность и определяется только в Росси и странах ближнего зарубежья. Ограничения в использовании ПТИ связаны с зависимостью параметра от исходной активности и чувствительности тканевого тромбопластина. Значения показателя одного и того же больного, измеренные в разных лабораториях, могут существенно отличаться. Референтные пределы 80-110%.

Все попытки полной замены определения ПТИ на протромбин в процентах по Квику в России не увенчались успехом. Это связано с объективными обстоятельствами. Во-первых, ряд лабораторий до сих пор приобретает не аттестованный тромбопластин. Во-вторых, многие лаборатории не имеют программируемых коагулометров. Проведение исследований на водяной бане повышает вероятность субъективных ошибок.

В настоящее время принято выражать ПВ в % по Квику. Несмотря на то, что время свертывания зависит от используемого тромбопластина, типа добавок в реагент, метода детекции (мануальная, автоматическая), типа образцов и калибровочного материала, это количественный метод, конечные результаты которого получают в соответствии с калибровочным графиком. Для построения графика готовят несколько концентраций протромбина донорской плазмы: без разведения (100%) и с разведением физраствором в несколько раз, например, в 2 (50%) и 4раза (25%). Допускаются и другие разведения, например, 75%. Если процент протромбина, указанный в паспорте плазмы-калибратора, отличается от 100, то расчет процента проводят, исходя из реальных цифр. Например, если исходное содержание протромбина по паспорту контрольной плазмы 96%, то следующие разведения составят 48% и 24% соответственно. После анализа калибровочных проб строится график в обратной системе координат, и процент протромбина определяется по графику. При ручной калибровке результаты ограничены 100% активностью и могут быть определены только по калибровочному графику, что для среднего медперсонала представляет сложность. Таким образом, лаборатории без должного оборудования обречены на ПТИ.

Коагулометры, как правило, имеют программу, которая после проведения калибровки результаты в сек переводит в % по Квику, поэтому ручное построение графика не требуется. Референтные пределы 70-130%.

ПТИ % не соответствует процентам по Квику.

Клиническая интерпретация.

Снижение активности (гипокоагуляция) - удлинение ПВ, снижение ПТИ и протромбина по Квику в %, наблюдается при недостатке факторов свертывания крови из-за естественного или индуцированного лекарствами снижения синтеза или ингибировании факторов.

1. Наследственный или приобретенный дефицит факторов, задействованных во внешнем пути активации протромбиназы (VII, Х, V, II, I).

2. Дефицит витамина К (II, VII и X факторы образуются в гепатоцитах в присутствии витамина К).

3. Прием лекарственных средств - антагонистов витамина К, АНД (варфарина, фенилина) и усиливающих их действие препаратов: анаболических стероидов, клофибрата, глюкагона, тироксина, индометацина, неомицина, оксифенбутазона, салицилатов; гепарина, урокиназы.

4. ДВС-синдром.

5. Присутствие в пробе первичных и вторичных антикоагулянтов (гепарин, ПДФ).

6. Присутствие патологических ингибиторов свертывания.

7. Заболевания печени со снижением синтетической функции.

Повышение активности (гиперкоагуляция) - укорочение ПВ, рост ПТИ и протромбина по Квику в %, отражает массивное поступление тканевого фактора в кровоток (травма, некроз), активацию свертывания во время беременности или после родов, недостаток физиологических антикоагулянтов.

АНД, будучи антагонистами витамина К, влияют как на внешний, так и на внутренний путь активации протромбиназы. Однако эффект больше выражен на внешнем каскаде, и ПВ меняется больше, чем АЧТВ. При лечении АНД в начале терапии из-за большого количества флуктуаций используется ПВ, а при стабилизации лечения – МНО.

МНО – расчетный показатель, принятый ВОЗ в 1983г. для контроля лечения антикоагулянтами непрямого действия. Международный Индекс Чувствительности (МИЧ, International Normal Ratio - INR) необходим для приведения данных ПО, определяемых с различными тромбопластинами, к величине, которая была бы определена первичным стандартом тромбопластина (эталоном). Производители реактивов определяют чувствительность каждой серии тромбопластинов, сравнивая ее с эталоном, и указывают значение МИЧ в паспорте к набору. Оптимально работать с тромбопластинами, имеющими МИЧ, близкий к 1 (0,96-1,5).

При наличии гипокоагуляции МНО повышается. Использование МНО позволяет оценить степень гипокоагуляции независимо от используемого тромбопластина. В результате появляется возможность сравнивать данные, полученные в разных лабораториях. Определение МНО возможно только при использовании аттестованного по МИЧ тромбопластина. Допускается проведение анализа ручными методами. Оптимальные пределы МНО, которые должны быть достигнуты в ходе лечения антикоагулянтами непрямого действия, зависят от терапевтических целей и определяются лечащим врачом. Обычно для профилактики гиперкоагуляции МНО поддерживается в пределах 2-2,5. Высокое МНО (4,5) иногда используется в лечебных целях, но чревато возможностью возникновения кровотечения.

МНО не используется:

1. Для скрининговых исследований.

2. В начале терапии АНД.

3. При оценке функции печени.

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).

Термин частичное (парциальное) обусловлен использованием в составе реактивов фосфолипидов, а не тканевого фактора. АЧТВ относится к фосфолипидзависимым тестам. Он предназначен для оценки внутреннего механизма образования протромбиназы. Во внутреннем каскаде участвуют ВМК, ПК, XII, XI, IX, VIII, X, V, II и I факторы, из них IX, X и II – витамин К- и Са⁺⁺-зависимые.

Основные области применения: как скрининговый тест, контроль за лечением гепарином, первичное выявление волчаночного антикоагулянта (ВА).

Принцип метода состоит в определении времени свертывания БТП при запуске его по внутреннему механизму после добавления кальция в условиях стандартизации контактной и фосфолипидной фаз коагуляции. Контактная фаза может быть активирована веществами неорганического (каолином, сульфатидами) и органического (эллаговой кислотой) происхождения.

На результаты исследования значительно влияет состав фосфолипидов, которые являются заменителем 3-его фактора тромбоцитов (Р₃).Они могут быть представлены фосфолипидами мембран тромбоцитов, фосфолипидами синтетического происхождения или выделенными из тканей животных и человека, фосфолипидами растительного происхождения (из сои), смесью животных и растительных фосфолипидов, фосфолипидами из мембран эритроцитов человека (эрилид, эритрофосфатид). В зависимости от того, выявление каких нарушений приоритетно для данной лаборатории, выбираются соответствующие наборы реагентов. Так, сочетание эллаговой кислоты и соевых фосфолипидов чувствительно к дефициту факторов и присутствию гепарина, а каолина и эрилида – как к дефициту факторов, гепарину, так и к волчаночному антикоагулянту.

Метод плохо стандартизируется, результаты зависят от прибора и используемых реагентов, поэтому свойства реактивов должны быть известными. Желательно пользоваться реактивами одного производителя. В ряде случаев полезно рассчитывать отношение АЧТВ больного/АЧТВ донора (нормальной контрольной плазмы).

При проведении теста на АЧТВ воспроизводимость результатов зависит от соблюдения времени преинкубации плазмы с фосфолипидами и активатором контактной фазы перед добавлением СаCl₂. Время преинкубации, указанное в методике анализа, должно неукоснительно соблюдаться.

Клиническая интерпретация.

Удлинение АЧТВ (гипокоагуляция):

1. Дефицит факторов внутреннего пути.

2. Наличие гемофилии (врожденный дефицит факторов VIII и IX вызывает соответственно гемофилию А и В).

3. Дефицит витамина К или лечение АНД (витамин-К-зависимые факторцы II, IX и X участвуют во внутреннем пути).

4. Лечение гепарином и другими антикоагулянтами прямого действия.

5. ДВС-синдром в фазу гипокоагуляции.

6. Заболевания печени со снижениием синтетической функции.

7. Присутствие в пробе вторичных антикоагулянтов (ПДФ и др.).

8. Присутствие патологических ингибиторов свертывания.

9. Наличие волчаночного антикоагулянта (ВА).

Гепаринотерапия и введение гепарина в тестируемую плазму ведет к дозозависимому удлинению АЧТВ. При введении терапевтических доз ОГ время свертывания в тесте АЧТВ должно удлиняться в 1,5-2,5 раза по сравнению со средним по серии, а не с АЧТВ пациента. При длительном лечении гепарином, а также после фибринолитической терапии может развиться резистентность (устойчивость) к гепарину. Она проявляется в укорочении времени АЧТВ на фоне неизменной дозы гепарина. Данный факт свидетельствует о неэффективности лечения и возрастанию риска тромбоза. Устойчивость к гепарину чаще всего связана с недостатком антитромбина, поэтому пациентам на гепаринотерапии рекомендуется определять антитромбин. Другими причинами может быть высвобождение тромбоцитами гепарин-нейтрализующих веществ или увеличение их уровня в острой фазе воспаления. Введение НМГ в настоящее время принято контролировать остаточной активностью фактора Ха, хотя АЧТВ удлиняется аналогично введению ОГ.

При лечении АНД АЧТВ рекомендуется измерять в начале лечения, а также при длительном приеме препаратов. Время свертывания, как правило, удлиняется в 2-2,5 раза по отношению к норме. При приеме оральных антикоагулянтов между цифрами АЧТВ и ПВ корреляции не выявлено.

Влияние патологических ингибиторов и волчаночных антикоагулянтов (ВА) более подробно будет рассмотрено в тесте на ВА.

Укорочение АЧТВ (гиперкоагуляция) свидетельствует о тромбофилии. Причиной может быть резистентность фактора V к протеину С, повышение уровня фактора VIII, активация факторов, физиологическое повышение свертывания крови при беременности.

Часто укорочение АЧТВ связано с нарушением работы с кровью на преаналитическом этапе.

Тромбиновое время

Тромбиновое время (ТВ) характеризует конечный этап процесса свертывания плазмы: превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. Тест является скрининговым на полимеризацию фибриногена/фибрина и на антикоагулянтную активность плазмы.

Принцип метода заключается в определении времени свертывания БТП при добавлении к ней стандартной концентрации тромбина. Так как тромбин непосредственно активирует фибриноген, тест не нуждается в добавлении кальция или каких-либо дополнительных реагентов. При проведении теста используется тромбин низкой или средней концентрации. Тромбин низкой концентрации вызывает образование сгустка в течение 15-20 сек. (референтные значения указаны в методике анализа). Он используется для скриниговых исследований. При работе с плазмой, содержащей гепарин, рекомендуется более высокая концентрация тромбина, так как комплекс антитромбин-гепарин, который образуется при введении гепарина, быстро нейтрализует добавленный тромбин. Тест очень чувствителен к гепарину. Сразу после внутривенного введения гепарина и в терминальной фазе ДВС-синдрома в тромбиновом тесте кровь не сворачивается. ТВ удлиняется при заборе крови через катетер, обработанный гепарином.

Для правильной интерпретации результатов теста к пробе крови, содержащей гепарин, допускается добавить протаминсульфат для нейтрализации гепарина или измерить рептилазное время. Рептилаза или батроксобин – это коагулаза из яда змеи щитомордника. Она действует аналогично тромбину, но не подвержена влиянию гепарина.

Удлинение ТВ (гипокоагуляция):

1. Снижение концентрации фибриногена до 1-0,5 г/л.

2. Качественное изменение молекулы фибриногена (дисфибриногенемия).

3. Введение антикоагулянтов прямого действия (гепарина).

4. Высокое содержание ПДФ при повышенном фибринолизе, лечении фибринолитиками, ДВС-синдроме.

5. Наличие патологических ингибиторов.

Ингибиторы, удлиняющие ТВ, делятся на ингибиторы полимеризации, которых большинство, и ингибиторы тромбина. Ингибиторы полимеризации – это аномальные иммуноглобулины, которые нарушают процесс полимеризации фибриногена. Все ингибиторы ассоциированы с основным заболеванием, например, множественной миеломой, и представлены парапротеинами или криоглобулинами. При наличии ингибиторов тромбина время свертывания в рептилазном тесте остается нормальным.

В ряде случаев удлинение ТВ наблюдается при уремии и при наличии ВА.

Определение ТВ полезно при проведении фибринолитической и гепаринотерапии.

Укорочение ТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и риске тромбозов.

 

Фибриноген.

Фибриноген – это белок плазмы крови, который синтезируется в печени. Содержание фибриногена практически не зависит от пола и возраста. Хотя сам по себе он не активирует гемостаз, эпидемиологические исследования показали, что фибриноген является независимым фактором риска инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Рост содержания фибриногена увеличивает тенденцию к тромбообразованию, усиливает агрегацию тромбоцитов, ухудшает реологические свойства крови, способствует атеросклерозу и повышает риск развития тромбозов. Однако пределы для терапевтического вмешательства пока не определены.

Фибриноген является белком острой фазы воспаления. При тяжелых бактериальных инфекциях, травме, тромбозе он может повышаться до 10г/л и более. Рост содержания фибриногена коррелирует с повышением СОЭ.

Референтные пределы 2-4 г/л.

Основные методы определения.

1. Клоттинговый метод по Клаусу является наиболее адекватным и распространенным методом и относится к функциональным тестам. Он основан на определении времени образования сгустка при добавлении к разведенной в 10-20 раз плазме тромбина в высокой концентрации. Между временем образования сгустка и концентрацией фибриногена выявлена логарифмическая зависимость. Метод требует предварительного построения калибровочного графика в соответствии с инструкцией к набору реактивов. При отсутствии программируемых коагулометров данным методом пользоваться нежелательно: небольшая погрешность в определении времени коагуляции приводит к значительным ошибкам в содержании фибриногена. К ограничениям метода относится чувствительность результатов к гипер-, дис-, гиперфибриногенемии и избытку ПДФ, которые снижают активность полимеризации фибриногена.

2. Определение фибриногена по Р.А. Рутберг. Метод основан на взвешивании высушенного фибринового сгустка после добавления к 1 мл плазмы тромбопластин-кальциевой смеси или тромбина. Метод ручной, мало чувствительный и воспроизводимый и считается устаревшим. Однако при гипо- и дисфибриногенемиях его результаты более надежные, чем при методе Клауса.

3. Другие методы (турбидиметрические, фотометрические с использованием хромогенных субстратов, иммунохимические) относятся к концентрационным, так как непосредственно определяют концентрацию фибриногена.

Увеличение содержания (гиперкоагуляция): воспаление, некроз, курение, заболевания почек, коллагенозы, новообразования, атеросклероз, прием оральных контрацептивов, беременность, сахарный диабет, ожирение, стресс.

Снижение содержания (гипокоагуляция ): врожденный дефицит, ДВС, печеночно-клеточная недостаточность, острый фибринолиз, лейкозы, инфекционный мононуклеоз, действие лекарственных препаратов (рептилаза, фибраты, фенобарбитал, стрептокиназа, урокиназа, актилизе и др.), физическая нагрузка.

Дисфибриногенемия характеризуется наличием функционально дефектной молекулы фибриногена в плазме крови. Наследственные дисфибриногенемии встречаются редко. Они протекают чаще бессимптомно, иногда с тенденцией к кровоточивости или тромбозам. Приобретенная дисфибриногенемия наблюдается у пациентов с тяжелыми заболеваниями печени. Дисфибриногенемии характеризуются следующими лабораторными показателями:

· увеличением тромбинового и рептилазного времени,

· расхождением результатов при измерении уровня фибриногена функциональным тестом (по Клаусу, низкое) и концентрационным (более высокое или нормальное).

 

Дополнительные тесты.

Оценка системы фибринолиза. Фибринолитическая активность.

Для оценки системы фибринолиза можно проводить тесты, которые позволяют измерить концентрацию тех или иных факторов (плазминоген, α₂-антиплазмин, концентрацию плазмин-антиплазминового комплекса и др.). Однако наиболее общее представление о системе фибринолиза может быть получено при проведении традиционного функционального теста – оценки фибринолитической активности крови (ФАК). Тест отличает простота исполнения и отсутствие специального оборудования. Недостатком является невозможность автоматизации. Результат теста на ФАК зависит от уровня фибриногена, качества полимеризации фибрина и наличия гепарина.

В настоящее время используется две модификации теста.

1. Спонтанный эуглобулиновый фибринолиз. При осаждении белков плазмы крови слабой, как правило, уксусной кислотой, происходит осаждение так называемой эуглобулиновой фракции, которая содержит фибриноген, факторы свертывания, плазминоген и его активаторы, но практически свободна от ингибиторов фибринолиза. При таком мягком осаждении белки не теряют своих свойств. После растворения осажденных белков в буферном растворе, добавлении CaCl₂ и образовании после этого фибринового сгустка время лизиса сгустка отражает ФАК. Референтные пределы 2-4 часа.

2. XIIа-зависимый фибринолиз (или Хагеман-зависимый фибринолиз, ф. XII - фактор Хагемана) отличается от спонтанного тем, что при осаждении белков в реакционную смесь добавляют каолин. Каолин является активатором ф. XII и внутреннего пути фибринолиза. Время проведения анализа резко сокращается, так как лизис сгустка составляет 4-12 мин.

При выборе метода оценки ФАК необходимо учитывать особенности патологии пациента. Так, при скрининговых исследованиях, при обследованиях беременных и других пациентов с тромбофилией, адекватным будет определение XIIа-зависимого фибринолиза. Для пациентов с ДВС-синдромом, после операций на органах внутренней секреции или с метастазирующими опухолями, а также при других состояниях с возможностью гиперфибринолиза, более подходит определение спонтанного эуглобулинового фибринолиза: при активации фибринолиза время лизиса сгустка сокращается, а достоверно визуально отследить растворение сгустка за период времени менее 4-х минут практически невозможно.

Активация фибринолиза (укорочение времени лизиса сгустка, гипокоагуляция) наблюдается при уменьшении концентрации фибриногена, гипо- и дисфибриногенемиях, панкреатитах и панкреонекрозах, операциях на органах внутренней секреции и легких, акушерских осложнениях, введении адреналина, пирогенных реакциях, метастазирующих опухолях, ДВС-синдроме, снижении уровня ингибиторов плазминогена, лечении фибринолитиками и активаторами плазминогена.

Ингибирование фибринолиза (удлинение времени лизиса сгустка, гиперкоагуляция) наблюдается при гиперфибриногенемии, врожденном дефиците плазминогена или его аномалиях, снижении плазминогена и его активаторов при повышенном потреблении или сниженном синтезе (тромбозы, васкулиты, сепсис, заболевания печени, ДВС-синдром), беременности.

Тест может применяться для контроля эффективности лечения фибринолитиками.