Культуральные свойства бактерий

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению. По происхождению среды бывают естественными (натуральными) и искусственными (синтетическими). К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а ипользуются, в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды.Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса, используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор.В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса, содержащие пептон, агар, один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта, состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.

Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные. К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов - углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными. По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими. Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких, добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%. Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар. Агар плавится примерно при температуре 100 ° С и застывает при 40 ° С. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатины ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют, в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикогель и каррагенан, получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной средой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.

Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.

По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:

основные или универсальные простые среды, например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;

специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, дефибринированную кровь для дифтерийной палочки. Среди сложных сред можно выделить избирательные или элективные среды. Они предназначены для выделения и культивирования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена, сальмонелл из испражнений - среду Плоскирева. В сложном составе таких сред содержатся вещества, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Такими веществами могут быть анилиновые красители, желчь, хлористый натрий в концентрации выше 1%.

Разновидность элективных - селективные питательные среды. В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдельных групп микроорганизмов, но и стимуляторы роста отдельных видов бактерий.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной субстрат. Существуют среды для определения гликолитической активности бактерий, в их состав входят один (среды Гисса), два (среды Ресселя) или три (среда Клиглера) сахара. Протеолитическую активность бактерий изучают на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке. Возможность ферментировать более простые азотсодержащие соединения изучают на питательных средах с аминокислотами, бульоне с мочевиной.Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов агрессии исследуют на кровяных агарах, желточно-солевом агаре, безсывороточном фосфатном агаре и других подобных средах.Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных режимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизующей фильтрации.

ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.

Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.

Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.

Ферменты бактерий подразделяются на экз о- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов. В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов. Известны также ферменты, которые получили название аллостерических. Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.

Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма, обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы, нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии, для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.

Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления - кислоты, спирты, альдегиды, Н2О и СО2;

протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода. Для изучения активности ферментов при идентификации микроорганизмов широко используют дифференциально-диагностические среды, в состав которых входят определенные субстраты - сахара или белки.

При исследовании гидролитической активности бактерий распространены МОНОСУБСТРАТНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ ГИССА (пестрый ряд Гисса), лактозосодержашие среды Эндо, Левина, Плоскирева, дисубстратные среды Ресселя, полисубстратные среды Клиглера и Олькеницкого. Последние могут служить и для изучения протеолитических свойств бактерий, так как рост микроорганизмов сопровождается высвобождением аммиака. Протеолитические ферменты бактерий определяются также по выделению индола, сероводорода, расщеплению некоторых аминокислот, например, фенилаланина, лизина, цистина. Протеолитические ферменты способны изменять (разжижать) желатину, причем, разные виды бактерий по разному изменяют «столбик» желатины в пробирке с посевом микроорганизма. Так, при росте холерного вибриона «столбик» желатины принимает форму гвоздя, при росте стафилококка - чулка, при росте синегнойной палочки наблюдается послойное разжижение среды.

Окислительно-восстановительные ферменты, дегидрогеназы, каталазу определяют по изменению органического красителя - акцептора водорода. Способность микроорганизмов использовать в качестве источника углерода цитрат оценивают в специальных тестах основанных на работе ферментов.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микр о- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Почти все факторы физического воздействия на микроорганизмы могут быть использованы с целью стерилизации. Под стерилизацией понимают обеспложивание, освобождение материалов, растворов, питательных сред от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Стерильность - понятие абсолютное, оно означает полное отсутствие микроорганизмов, как на поверхности, так и внутри стерильного объекта.

В практике широко используют несколько способов стерилизации: термическая (под действие высоких температур) и холодная (с помощью ультразвука, излучения, фильтрации).

Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов. Различают следующие способы тепловой стерилизации:

Прокаливание - это самый старый и надежный способ стерилизации. В пламени горелки прокаливают бактериологические петли, препаровальные иглы, кончики пинцетов и ножниц, предметные стекла. При этом бактерии, грибы и их споры сгорают.

Кипячение - для стерилизации металлических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок используют кипящую воду. При 100 ° С (температура кипящей воды) вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро, в течение нескольких минут. Споры (бациллы сибирской язвы, ботулизма) выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирусы гепатита В - около часа. Стерилизацию осуществляют в специальных металлических сосудах - стерилизаторах, которые могут быть снабжены электро-нагревом. Существует большое количество типов стерилизаторов, отличающихся по объему и устройству.

Стерилизация сухим жаром - Для стеклянной посуды чаще всего используют стерилизацию сухим жаром. Ее проводят в специальных суховоздушных (сухожарочных) шкафах, имеющих датчики - регуляторы температуры. Режимы стерилизации включают температуру и время. Наиболее часто используют следующие режимы стерилизации сухим жаром: Температура, ° С Время, мин

140 180

150 150

160 120

170 60

При таких режимах погибают как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов.

Автоклавирование - стерилизация насыщенным паром под давлением. Проводится при температуре выше точки кипения воды. Это наиболее надежный и распространенный способ стерилизации. Особая эффективность этого способа достигается при совместном действии пара и высокой температуры. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся аппаратах с толстыми стенками - автоклавах. Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для измерения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого, термометра для измерения температуры внутри камеры. Имеется паровой котел с нагревателем воды. При кипячении воды пар поступает в камеру автоклава. Автоклав герметически закрывают крышкой или дверью с плотной резиновой прокладкой. Автоклавирование проводит специально подготовленный специалист, так как работа по обслуживанию аппарата, работающего под давлением требует подготовки и строгого соблюдения правил техники безопасности. Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121 °C, 1,5 атм - 125 °C, 2,0 атм - 134 °C. При таких режимах автоклавирования вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение нескольких минут, а споры в течение 20-30 мин. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свой ств ст ерилизуемого материала. Так, питательные среды стерилизуют 20-30 мин при 1 атм, перевязочный материал и резиновые изделия от 1 до 2 часов при 1,0-1,5 атм. Для контроля режима стерилизации используют вещества с определенной температурой плавления. Их смешивают с метиленовой синью, помещают в ампулы или небольшие флаконы и раскладывают в автоклаве перед началом автоклавирования. К таким контролирующим веществам относятся бензаурин, температура плавления 115 °C, соответствует - 0,5 атм; бензойная кислота, температура плавления 121 °C, соответствует - 1,0 атм; мочевина, температура плавления 132 °C, соответствует - 2,0 атм; глюкоза, температура плавления 146 °C; тиомочевина, температура плавления 180 °C. Эти вещества расплавляются при достижении в сосуде соответствующей температуры и окрашиваются в цвет добавленного красителя.

Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и питательные среды, которые разрушаются при стерилизации под давлением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при избыточном нулевом давлении и температуре 100 °C. Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в 1 сутки, во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур.

Пастеризация предусматривает уничтожение в материале только вегетативных форм микроорганизмов и применяется в пищевой промышленности. При этом используют кратковременное нагревание до 90-92 °С в течение 2-5 сек или более длительное - в течение 5-10 мин нагревание до 70-75 °С. Обработанные таким образом материалы считаются пастеризованными, но не стерильными, так как содержат споры.

Холодная стерилизация осуществляется в отношении материалов, сред и растворов, которые изменяют свойства при тепловой стерилизации. Стерилизация фильтрованием показана для синтетических сред определенного состава, содержащих термолабильные аминокислоты, витамины, белки, для антибиотиков, ароматических углеводородов. Фильтрование проводится через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Диски, изготовленные из асбеста с целлюлозой называют фильтрами Зейтца. Их помещают в специальный фильтродержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав держатель с колбой или бутылью, под давлением пропускают стерилизуемый раствор. Широкое применение нашли мембранные фильтры. Их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Фильтры имеют поры размером от 0,22 до 100 мм. В фильтродержатели монтируют фильтры с разной величиной пор, от больших к меньшим и при фильтрации растворов постепенно «отсеивают» микроорганизмы различных размеров. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм «Миллипор», «Синпор», «Владипор». После стерилизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при температуре 37 ° С.

 

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ МЕТОДАМИ РАЗВЕДЕНИЙ И ДИСКОВ

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35о-37оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35о-37оС проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

 

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению. По происхождению среды бывают естественными (натуральными) и искусственными (синтетическими). К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а ипользуются, в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды.Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса, используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор.В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса, содержащие пептон, агар, один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта, состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.

Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные. К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов - углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными. По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими. Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких, добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%. Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар. Агар плавится примерно при температуре 100 ° С и застывает при 40 ° С. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатины ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют, в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикогель и каррагенан, получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной средой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.

Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.

По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:

основные или универсальные простые среды, например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;

специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, дефибринированную кровь для дифтерийной палочки. Среди сложных сред можно выделить избирательные или элективные среды. Они предназначены для выделения и культивирования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена, сальмонелл из испражнений - среду Плоскирева. В сложном составе таких сред содержатся вещества, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Такими веществами могут быть анилиновые красители, желчь, хлористый натрий в концентрации выше 1%.

Разновидность элективных - селективные питательные среды. В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдельных групп микроорганизмов, но и стимуляторы роста отдельных видов бактерий.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной субстрат. Существуют среды для определения гликолитической активности бактерий, в их состав входят один (среды Гисса), два (среды Ресселя) или три (среда Клиглера) сахара. Протеолитическую активность бактерий изучают на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке. Возможность ферментировать более простые азотсодержащие соединения изучают на питательных средах с аминокислотами, бульоне с мочевиной.Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов агрессии исследуют на кровяных агарах, желточно-солевом агаре, безсывороточном фосфатном агаре и других подобных средах.Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных режимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизующей фильтрации.

ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.

Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.

Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.

Ферменты бактерий подразделяются на экз о- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов. В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов. Известны также ферменты, которые получили название аллостерических. Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.

Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма, обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы, нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии, для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.

Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых явл