Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется.

К 5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наклоненной пробирки приливают 5 капель исследуемого раствора белка таким образом, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворяется.

3. Осаждение белков органическими кислотами

Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков.

Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков. При использовании трихлоруксусной кислоты удается отдельно определить содержание азота белков и азота других азотсодержащих веществ: пептидов, мочевины, аминокислот.

К 5 каплям исследуемого раствора белка добавляют 2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

Осаждение белков органическими растворителями

Метод основан на способности органических растворителей нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция происходит лучше в присутствии электролита хлорида натрия вследствие снятия заряда с частиц белка.

Реакция осаждения белка спиртом при кратковременном действии спирта на холоде обратима. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок сохранит нативное состояние и может быть вновь растворим в воде. При длительном воздействии спирта наступает необратимая реакция осаждения, то есть денатурация белка.

К 5 каплям раствора исследуемого белка приливают 20 капель этилового спирта (или ацетона). Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. При стоянии выпадает осадок белка.

Указания к составлению отчета. При составлении отчета указать название веществ, осаждающих белки, характер и цвет осадка, чем обусловлена реакция и ее особенности.

Контрольные вопросы:

1. Какие уровни организации белковых молекул вы знаете?

2. Чем обусловлены реакции осаждения белков?

3. Чем может быть вызвана денатурация белков?

4. В чем преимущество концентрированной азотной кислоты по сравнению с другими минеральными кислотами?

5. Почему при отравлении солями тяжелых металлов пьют молоко и сырые яйца?

Лабораторная работа №6

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Цель работы – освоить метод количественного определения белка в биологическом материале и познакомиться с использованием стандартных тест-систем.

Для количественного определения белков в биологическом материале чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. К азотометрии относится классический метод Кьельдаля и его модификации. Эти методы очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19.

Фотоколориметрические методы основаны на цветных реакциях на функциональные группы белков. Среди них наиболее частое применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот. Биуретовый метод является более специфичным, так как ему не мешают примеси – свободные аминокислоты и фенольные соединения.

Спектрофотометрические методы делят на прямые и косвенные. Последние представляют собой более чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка. Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в УФ-области при 200–220 нм (пептидные группы белка) и при 280 нм (ароматические радикалы аминокислот). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов, однако для их применения необходимо специальное оборудование.

Для рутинных исследований в биологических и медицинских лабораториях в основном пользуются стандартизированными наборами реагентов, так как работа с ними значительно сокращает подготовительную часть работы, существенно повышает правильность определения концентраций и упрощает расчетную часть за счет использования стандарта. Применительно к нашей задаче существует набор для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (Total Protein FL-E – производитель «Витал Диагностикс СПб», использующий стандарт фирмы Sigma).

Метод основан на способности белка образовывать окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в исследуемом материале.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови.

Реактивы: набор для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (Total Protein FL-E «Витал Диагностикс СПб»), в который входит:

1. Концентрат биуретового реактива, содержащий натр едкий 0,5 моль/л; калий-натрий виннокислый 80 ммоль/л; калий йодистый 75 ммоль/л; сульфат меди 30 ммоль/л. Концентрат стабилен в темноте при комнатной температуре. Перед проведением анализа необходимое количество разводят в 5 раз (1 часть концентрата + 4 части дистиллированной воды).

2. Стандарт, содержащий альбумин сывороточный 70 г/л; натрий хлористый 154 ммоль/л. Стабилен не менее года при комнатной температуре.

Оборудование:

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Штатив с пробирками.

3. Пипетки на 5 мл и 100 мкл.

Ход работы. Взять три пробирки. В первую пробирку (опыт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл сыворотки или плазмы крови. Во вторую пробирку (стандарт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл стандарта. В третью пробирку (контроль) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 30 минут.

Содержимое опытной и стандартной пробирки фотометрируют против контроля при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см не позже чем через час после начала инкубации.

Указания к составлению отчета. Концентрацию общего белка рассчитывают в г/л по формуле

г/л = (Е _опыт/ Е _{стандарт}) × 70,

где Е _опыт – экстинкция опыта,

Е _{стандарт} – экстинкция стандарта,

70 – концентрация белка в стандарте в г/л.

Контрольные вопросы:

1. Какая реакция лежит в основе метода и на чем она основана?

2. В чем преимущество определения концентрации веществ по стандарту перед определением по калибровочному графику?

Лабораторная работа №7

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Цель работы – закрепить теоретические знания по теме «Нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды» и приобрести навыки качественного определения компонентов нуклеиновых кислот, образующихся в результате гидролиза нуклеопротеидов.

Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. При продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов. С помощью специальных реакций можно открыть в гидролизате составные части нуклеопротеидов. Биуретовой реакцией устанавливают наличие полипептидов. Пуриновые основания обнаруживают по осадку серебряных солей, фосфорную кислоту – по реакции с молибдатом аммония, а пентозу – пробой Троммера.

Исследуемый материал: пекарские дрожжи.

Реактивы:

1. 10% раствор серной кислоты.

2. Аммиак концентрированный.

3. 2% аммиачный раствор нитрата серебра (к 2% раствору нитрата серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка).

4. 10% раствор NaOH.

5. 7% раствор CuSO₄.

6. 1% раствор CuSO₄.

7. Молибдат аммония в азотной кислоте (7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты; полное растворение молибдата аммония происходит после добавления азотной кислоты).

8. 1% раствор аскорбиновой кислоты на 1М растворе HCl.

Оборудование:

1. Большая пробирка или круглодонная колба с пробкой, в которую вставлена длинная стеклянная трубка.

2. Песчаная баня.

3. Штатив с пробирками.

4. Пипетки.

5. Индикаторная бумага.

Ход работы. Помещают 1 г пекарских дрожжей в большую пробирку или круглодонную колбу, добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение часа. После прекращения кипячения охлаждают, фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на определение составных частей нуклеопротеидов.