Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Вирус лейкоза крупного рогатого скота присутствует в организме в виде ДНК-копий (провируса), встраиваясь в геном клетки-хозяина. Это делает возможным выявление ВЛКРС с помощью современных молекулярно-биологических методов, в частности методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для обнаружения провируса с помощью ПЦР используется геномная ДНК, выделенная из крови животных. В результате ПЦР определенный вирусоспецифический фрагмент выделенной ДНК амплифицируется (умножается) до количества, достаточного для его визуального определения.

ПЦР представляет собой серию циклов, в течение которых происходит ферментативный синтез специфического участка нуклеиновой кислоты. Каждый цикл включает три этапа: при нагревании до 94 - 95 °С происходит разделение молекулы геномной ДНК на две комплементарные цепи (денатурация); при охлаждении до 48 - 65 °С с цепями ДНК соединяются специфические олигонуклеотидные праймеры (отжиг); при нагревании до 72 °С термостабильная ДНК-полимераза достраивает цепи ДНК, ограниченные парой праймеров (синтез и элонгация). В результате реакции за один цикл количество специфического фрагмента ДНК увеличивается вдвое, и, в зависимости от количества циклов, можно получить более миллиона его копий.

Как диагностический метод ПЦР характеризуется высокой специфичностью, которая обусловлена выбором праймеров, и чувствительностью. С помощью ПЦР удается обнаруживать даже деградированную нуклеиновую кислоту, присутствующую в следовых количествах. Для проведения ПЦР-анализа достаточно 50 мкл крови, и результат может быть получен в течение рабочего дня.

Метод ПЦР может использоваться для диагностики лейкоза крупного рогатого скота наряду с серологическими методами, а также в качестве подтверждающего теста.

Для идентификации специфического фрагмента используют стандартные маркеры - наборы фрагментов ДНК известной длины. При просмотре геля в ультрафиолете присутствие фрагмента определенного размера свидетельствует о наличии в пробе провирусной ДНК.

Бешенство (Rabies)

Водобоязнь, гидрофобия – это остро протекающая инфекционная болезнь, характеризующаяся признаками диссеминированного полиоэнцефаломиелита. Важным этапом дальнейших научных исследований было открытие специфических включений в нейронах ГМ.

Возбудитель. Нейротропный вирус – принадлежит к семейству Rhabdoviridae, рода Lissavirus. Он имеет однониточную РНК и окружен оболочкой, имеет пулевидную форму.

Эпизоотология. Восприимчивы все виды домашних и диких теплокровных животных, а также человек. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих и куньих, летучие мыши, грызуны многих видов, а также домашняя кошка.

В 2015 году зарегистрировано 3424 случая. Большое количество случаев бешенства в Центральном, Приволжском, Уральском Ф.О. На Центральный федеральный округ приходилось – 45% от числа заболевших в России, далее идут Приволжский ФО – 32%, Уральский ФО – 6,0%, Сибирский ФО 5,0%, Южный ФО – 6,0%.

В 2016 году уже зарегистрировано 1075 случаев.

Источник. Резервуаром вируса служат только дикие и домашние плотоядные животные определенных видов, а в некоторых районах мира – летучие мыши. С учетом резервуара возбудителя различают эпизоотии природного и городского типов. При возникновении эпизоотии природного типа болезнь чаще всего распространяют дикие плотоядные.

Для штаммов рабического вируса, поддерживаемых в организме собак и волков, характерна высокая тропность к ЦНС и низкая – к висцеральным органам. Поэтому вирус выделяется со слюной, но он отсутствует в крови, моче, молоке больных животных.

Выделение вируса обычно происходит после начала клинических проявлений болезни, но поскольку самые первые признаки заметить очень трудно, то между началом выделения вируса и выявлением типичных симптомов проходит несколько дней. В связи с этим, подозрительных по заболеванию (беспричинно нанесших укусы) собак и кошек следует в течение 10 дней содержать в условиях строгой изоляции под клиническим наблюдением.

Интенсивность эпизоотии зависит от плотности поселения эти животных. При незначительной плотности популяций хищных животных эпизоотия затухает.

Патогенез. При заражении восприимчивого животного вирус непродолжительное время сохраняется у места внедрения, а затем по центростремительным нервным волокнам проникает в СМ и ГМ. Из мозга по центробежным нервным путям вирус попадает в слюнные железы.

Клинические признаки и течение. Инкубационный период чаще всего составляет 3-6 недель. Характерно острое течение.

При буйном течении различают 3 стадии развития болезни: продромальную, стадию возбуждения, стадию параличей.

-- Продромальная стадия длится от 12 часов до 3 суток, характеризуется изменением поведения животного. Собака выглядит угнетенной, забивается в угол или в конуру, неохотно идет на зов хозяина. В других случаях она чрезмерна ласкова, не отходит от хозяина, старается лизнуть ему руки, лицо (слюна в это время уже содержит вирус). Постепенно возрастает беспокойство и возбудимость. Могут появиться признаки галлюцинаций: животное яростно лает при виде давно знакомых предметов, как бы кусает кого-то в воздухе («ловит мух»). Нередко извращается аппетит.

Вторая стадия проявляется слюнотечением. Лай становится хриплым, часто переходит в вой. Нарастает агрессивность, собака без всякого повода может укусить другое животное или человека. У собаки исчезает чувство страха. За сутки бешеная собака может обежать десятки километров, нападая на встречающихся животных и людей. Нападает она обычно молча, без лая.

При тихой (паралитической) форме, которая часто встречается при заражении собак от лисиц, возбуждение выражено слабо или вообще отсутствует. Обычно первыми заметными признаками являются затруднение глотания, слюнотечение. Затем отвисает нижняя челюсть, быстро развивается паралич мышц конечностей и туловища и уже через 2-4 дня животное погибает.

Патизменения. Отмечают истощение, находят следы укусов, иногда-расчесов. Шерсть головы и шеи обычно смочена слюной. При вскрытии отмечают застойное полнокровие внутренних органов. Желудок обычно пуст, но у плотоядных в нем могут быть различные несъедобные предметы.

Диагноз. Мозг (свежий или консервированный 30-50% глицерином) в плотно закрытых стеклянных банках, помещенных в ящик. При взятии и упаковке материала обязательно соблюдают меры предосторожности, работа должна проводитсмя в перчатках, маскамх, защитных очках,)

Для экспресс диагностики бешенства могут быть использованы:

ü метод МФА – для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос

ü метод ПЦР – для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюны, спинномозговой или сложной жидкости

ü метод ИФА – для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или антипичным течением

ü метод биопробы – для выделения антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс диагностики используются комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3-4 сутки в МФА.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспензируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку КРС. Суспензия вводится интерацеребрально белым мышам массой 5-6г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

▪ Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов.

Основные достоинства МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью – менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Лечение. Заболевших животных немедленно изолируют и убивают, так как их передержка связана с риском заражения людей.

Иммунитет. Одним из основных и эффективных способов предотвращения бешенства является своевременная и эффективная иммунопрофилактика, основанная на использовании антирабических вакцин.

Профилактика и меры борьбы. Успех профилактических мероприятий зависит от согласованной работы всех заинтересованных служб при содействии населения. Органы коммунального хозяйства и местные советы должны обеспечить регистрацию имеющихся у населения собак, контроль за соблюдением правил содержания собак и кошек, уничтожение бродячих животных. Ветеринарные специалисты ежегодно проводят ревакцинацию собак и кошек.

Профилактика у с/х животных базируется на предохранении от нападения на них диких животных на пастбищах и фермах.

Помещения, в которых находились больные животные, дезинфицируют.

Грипп птиц

Грипп птиц — (Grippus avium) — высококонтагиозное, остро протекающее вирусное, поражающее сельскохозяйственных, синантропных и диких птиц заболевание с поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов.

Грипп птиц способен протекать в форме эпизоотий, вызывая массовый охват поголовья и имея широкое распространение-район, область, страна.

Экономический ущерб от гриппа птиц чрезвычайно велик и связан с массовой гибелью заболевшей птицы, затратами при проведение жестких карантинных и ветеринарно-санитарных мероприятий, включая уничтожение больной птицы. К примеру панзоотия птичьего гриппа в мире в 2005году нанесла материальный ущерб, который оценивается в 4млр. евро.

Возбудитель болезни – РНК-содержащий вирус относится к семейству ортомиксовирусов, который подразделяется на три серологических типа: А,В и С. Вирусы типа А вызывают заболевание у животных и человека.

Вирусы гриппа на основании типирования по основным антигенам (поверхностным белкам) - гемагглютинину (Н) и нейраминидазе (N) классифицируются соответственно на 15 и 7 субтипов. Для птиц наиболее патогенны вирусы подтипов Н5 и Н7. Наибольшую озабоченность вызывает вирус Н5N1 в связи с его возможной опасностью для человека.

Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, нагреванию и кислой среде (рН 3,0). При глубоком замораживании (температура -70°С) в мясе вирус остается вирулентными свыше 300дней. Высушивание субстрата, содержащего вирус, консервирует его.

Обычные дезинфектанты: хлорная известь, гидрооксид натрия, фенол, соляная кислота, карболовая кислота и другие быстро инактивируют вирус.

Эпизоотология. Грипп регистрируется у многих видов домашних и диких птиц. Вирус подтипа А выделен от кур, индеек, голубей, уток, гусей являясь при этом патогенным для кроликов, мышей, морских свинок и человека, у которого в случае возникновения осложнений возникает атипичная пневмония.
Среди диких и домашних птиц могут одновременно циркулировать несколько антигенных разновидностей вируса, свойственным человеку, птицам и домашним животным.

В хозяйствах промышленного типа в появлении заболевания определенную роль играет занос возбудителя инфекции с кормами, оборудованием, инвентарем при этом особую опасность представляет не продезинфицированная мясная и яичная тара.

Вся восприимчивая птица в хозяйстве, обычно переболевает гриппом в течение 30-40 дней. Это объясняется высокой контагиозностью вируса и высокой концентрацией птицы в птичниках.

Источником возбудителя инфекции служит переболевшая птица (в течение 2мес.). Вирус гриппа вызывает заболевание птиц при респираторном, пероральном, интраперитонеальном, подкожном и внутримышечном заражении. В промышленных предприятиях при клеточной системе содержания птицы основное значение в распространение возбудителя имеет аэрогенный путь, а также алиментарный (передача с питьевой водой). Из организма больной птицы вирус выделяется с экскрементами, секретом, пометом, инкубационным яйцом. В разносе вируса гриппа внутри птицеводческого хозяйства могут принимать участие грызуны, кошки и особенно свободно живущая дикая птица, проникающая в птичники или гнездящаяся в них.

Заболеваемость птицы варьирует от 80 до 100%, смертность от 10 до 90% в зависимости от вирулентности вируса и условий содержания птицы.

Патогенез. В результате попадания вируса на слизистые оболочки дыхательных путей он начинает активно размножаться и проникает в кровеносную систему. Все это происходит в течение 4-12 часов. Вирус в большом количестве содержится в сыворотке крови, а также в эритроцитах. В развитии болезни принято различать четыре фазы: активного размножения вируса и накопление его в паренхиматозных органах, вирусемия — вирус в эту фазу можно обнаружить в крови, затем начинается процесс синтезирования антител, что свидетельствует о прекращении дальнейшей репродукции вируса. Последняя стадия сопровождается активным образованием антител и формированием у птицы иммунитета.

Исходя из того, что вирус в процессе своей жизнедеятельности выделяет токсические продукты, у птицы в стадии вирусемии происходит интоксикация и гибель птицы. Это обычно происходит при остром течении болезни.

Клиническая картина. Инкубационный период составляет 3-5 дней. Грипп может протекать остро, подостро и хронически.

▪ При остром течении — птица отказывается от корма (анорексия), оперение становится взъерошенным, глаза закрытые, голова опущена, куры теряют яйценоскость. Видимые слизистые оболочки гиперемированы и отечны, у отдельной больной птицы из слегка приоткрытого клюва вытекает тягучий слизистый экссудат, носовые отверстия заклеены воспалительным экссудатом.

Гребень и сережки имеют темно-фиолетовый цвет. Дыхание становится учащенным и хриплым, температура тела поднимается до 44°С, а перед падежом падает до 30°С. Если заболевание у кур вызвано высокопатогенными вирусами гриппа, то как правило 100% кур погибает.

▪ Подострое и хроническое течение гриппа длится от 10 до 25 дней; при этом исход болезни находится в зависимости от резистентности заболевшей птицы. Смертность достигает 5-20%. При данной форме гриппа у больной птицы наряду с респираторными симптомами возникает диарея, помет становится жидким, окрашенным в коричнево-зеленый цвет. Кроме вышеуказанных признаков у больной птицы отмечается атаксия, судороги, некрозы, манежные движения, в предагональную стадию тоникоклонические судороги мышц шеи и крыльев.

Патологоанатомические изменения. Наиболее типичным для гриппа признаком является картина геморрагического диатеза, сопровождающаяся подкожными отеками в области глотки, гортани, шеи, груди, ног в которых содержится желатинозный экссудат. Данные отеки у птиц возникают в результате нарушения функции органов кровообращения. Отмечаются как массовые, так и единичные кровоизлияния под кожу, в мышцы, в паренхиматозные органы и слизистые оболочки.Постоянными патологоанатомическими признаками гриппы являются гастроэнтерит, бронхит, перикардит, перитонит, аэросакулит, отек легких, застойные явления во внутренних органах.

Диагноз. На основании эпизоотических особенностей течения болезни, характерных острых клинических признаков респираторной болезни и патологоанатомических изменений можно поставить предположительный диагноз. Для постановки окончательного диагноза необходимо провести комплекс лабораторных вирусологических исследований.

В лабораторию направляют патологический материал (печень, легкие, головной мозг и др.) от птиц павших в острую стадию болезни.

В лаборатории для выделения вируса применяют методы заражения куриных эмбрионов, для идентификации выделенного вируса — РГА, РТГА и РСК. Биологическая проба ставится на цыплятах 60-120-дневного возраста. Для ретроспективной диагностики используют РТГА, РДП, ИФА и ПЦР.

Диагноз на грипп птиц считают подтвержденным, если:

· выделен и идентифицирован высокопатогенный вирус;

· выделен и идентифицирован любой вирус подтипов Н5 или Н7;

· установлено наличие рибонуклеиновой кислоты (РНК), специфичной для высокопатогенного вируса любого подтипа или РНК вирусов подтипов Н5 или Н7, любого уровня патогенности в пробах патологического материала;

· обнаружены антитела к гемагглютининам подтипов Н5 и Н7, когда достоверно известно, что они не связаны с вакцинацией.

Дифференциальный диагноз. Генерализованную септицемическую форму гриппа дифференцируем от болезни Ньюкасла. Респираторную форму – от инфекционного бронхита,микоплазмоза, ларинготртахеита и других респираторных заболеваний птиц.

Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшая птица приобретает нестерильный иммунитет, который продолжается до 6 месяцев. Для специфической профилактики применяют инактивированную гидроокисьалюминиевую гидроксиламиновую эмбрионвакцину типа А, жидкую и сухую инактивированные вакцины против гриппа птиц. Вакцины вводят внутримышечно, инактивированные –двукратно с интервалом в 14дней. С профилактической целью в угрожаемых хозяйствах прививают только клинически здоровую птицу (кур, уток, индеек). Через 14-21 день после вакцинации птица приобретает напряженный иммунитет длительностью до 6 месяцев.

Профилактика. Основные ветеринарные правила содержания птицы:

· Не допускать въезд на территорию организации транспорта, не связанного с обслуживанием организации. Въезд транспорта разрешается только через постоянно действующие дезбарьеры и дезинфекционные блоки.

· Вход обслуживающему персоналу на территорию производственных помещений организации. где содержится птица, осуществляется через пропускник со сменой одежды и обуви на специальную (предназначенную для осуществления соответствующих производственных операций), прохождением гигиенического душа, мытьем головы.

· Для обслуживания за птицей закрепляют постоянный обслуживающий персонал, прошедший медицинское обследование и зоотехническую и ветеринарную подготовку.

· Посетителям организации рекомендуется избегать соприкосновения с птицей и готовыми кормами (кормовыми добавками) для птицы.

· Птичники (залы) комплектуют одновозрастной птицей.

· В племенных хозяйствах для упаковки и реализации инкубационных яиц запрещается использование бывшей в употреблении тары, которая не может быть подвергнута дезинфекции.

· Перед размещением очередной партии птиц предусматривается проведение в установленном порядке полной дезинфекции помещений с уборкой и очисткой помещений (включая удаление подстилки)

· В организациях, осуществляющих выращивание или разведение птицы, организуют контроль за состоянием кормов, воды и воздуха.

· Питьевая вода подвергается микробиологическому анализу не реже 1 раза в месяц.

· Кормление птиц должно осуществляться полнорационными комбикормами заводского изготовления, прошедшими термическую обработку при температуре, обеспечивающей уничтожение вирусов-возбудителей болезней птиц.

· В организациях проводят выбраковку больной и инфицированной птицы, которую убивают и обрабатывают отдельно от здоровой.

· Транспортировку мяса птицы и готовой продукции осуществляют в чистой, заранее продезинфицированной таре, специально для этой цели предназначенным транспортом.

· Содержать на территории организации кошек и собак, кроме сторожевых, находящихся на привязи возле помещения охраны или по периметру ограды, не рекомендуется.

Вакцинация птиц, содержащихся в ЛПХ, проживающих в населенных пунктах, вблизи которых расположены гнездопригодные водоемы для диких водоплавающих и околоводных птиц.

Проведение мероприятий по созданию неблагоприятных гнездовых условий для водоплавающих птиц на водоемах вблизи населенных пунктов. Задачей этих мер является отпугивание птиц от мест гнездования. С этой целью могут применяться технические помехи — установка звуковых и световых ограждений и устройств, укрытие локальных мест гнездования сетями, выкашивание.

Меры борьбы. При установлении в хозяйстве заболевания гриппом птиц устанавливается карантин. В неблагополучном птичнике больную и подозрительную в заболевании птицу выбраковывают, убивают бескровным способом и утилизируют. Условно здоровое поголовье убивают на мясо. Проводят тщательную дезинфекцию помещения.

Карантин в неблагополучном пункте может быть отменен не ранее 21 суток со дня уничтожения (утилизации) всего восприимчивого поголовья или убоя и переработки условно здоровых птиц, находившихся в неблагополучном пункте и проведения заключительной дезинфекции.

После отмены карантина в течение 3 месяцев для всех владельцев птиц следует ограничивать вывоз инкубационного яйца и живой птицы всех видов и возрастов в другие хозяйства.

Вакцинацию птицепоголовья против гриппа птиц после отмены карантина следует проводить на территории неблагополучного пункта на протяжении того периода времени, пока результатами лабораторного мониторинга не будет подтверждено отсутствие циркуляции вируса среди вакцинированного поголовья.