Для микробиологич. диагностики, изучение микроорг. И в биотехнологических целях микр. культивируются на искусств. пит. средах.

Рост микробной культуры – это процесс увеличения массы клеток микроорг. Скорость роста зависит от наличия во внешн.среде пит. Веществ, продуктов обмена, от температуры, влажности. Увеличение числа кл.популяции микроорг. – это размножение. Оно хар-ся временем генерации (интервал времени, за к-ый число клеток удваивается), также концентрацией бактерий. Бактерии всегда сущ. в виде многочисленной популяции и развитие бакт. популяций можно рассм.как замкнутую систему. В росте и размножении выделяют 4 фазы:

Лаг-фаза, фаза задержки размножения – начинается с момента пересева на свежую питательную среду. В это время клетка приспосабливается к условиям новой среда, интенсивно растут, но не размножаются.

Логарифмическая или экспоненциальная фаза – период быстрого роста, характеризуется активным размножением клетки и также накоплением в среде продуктов энергетического обмена.

Стационарная фаза или период зрелости культуры – наступает когда число клеток популяции перестает увеличиваться – это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образовавшихся и гибнувших клеток из-за накопления продуктов обмена.

Фаза отмирания х-ся преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток в популяции, связано с изменением физико-химических условий среды, истощаются питательные вещества и накапливаются токсины.

Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.
Метод окраски по Граму - наиболее распространенный сложный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин - до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель - йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный. Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют карболовый фуксин Циля, серную к-ту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином Циля и не обесцвечиваются к-той, некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке к-той и докрашиваются метиленовым синим. При изучении структуры микробной клетки используют целый ряд сложных методов. Так, для выявления капсулы у бактерий применяют метод Гинса, для обнаружения спор бактерий - метод Ауески, зерна волютина можно окрасить с помощью метода Нейссера. Для выявления жгутиков используют методы "сверхокраски", при к-рых клетки и отдельные их структуры увеличиваются в размерах и становятся видимыми под световым микроскопом. К методам "сверхокраски" относится, в частности, метод серебрения по Морозову. Он также может быть использован для окрашивания спирохет и даже наиболее крупных вирусов - вирусов оспы.
Универсальным методом О. м. является окраска по Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет,

16) После 30-60 мин. контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру клеток вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса. Индикатором наличия вируса в зараженных таким образом культурах клеток может служить: 1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток; 2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток; 3) положительная реакция гамагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс); 4) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара. 5) при отсутствии ЦПД, ГА или ГАдс. можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке. Индикация вируса основана на проявлении у животных признаков инфекционного заболевания, их гибели, характере патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглютинации.

17) Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:/ А лаг-фаза;/А фаза логарифмического роста;/А фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; а фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования (рис. 3.2). Лаг-фаза (от англ. lag — запаздывание) — период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг- фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов. Фазалогарифмического(экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до несколькихнедель.Интен­ сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

18) Б актериофаги (от бактерии и греч. phagos - пожиратель; буквально - пожиратели бактерий), фаги, бактериальные вирусы, вызывающие разрушение (лизис) бактерий и других микроорганизмов. Бактериофаги размножаются в клетках, лизируют их и переходят в др., как правило, молодые, растущие клетки. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал в 1898 русский микробиолог Н. Ф. Гамалея. В 1915 английский учёный Ф. Туорт описал это же явление у гнойного стафилококка, а в 1917 французский учёный Ф. назвал литический агент, проходящий через бактериальные фильтры, «Б».
Строение и химический состав. Частицы многих Бактериофаги состоят из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45-140 нм и отростка толщиной 10-40 и длиной 100-200 нм (рис.). Другие Бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие - нитевидны, размером 8х800 нм. Содержимое головки состоит преимущественно из дезоксирибону клейновой кислоты (ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60-70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) и небольшого количества (около 3%) белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда Бактериофаги чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих Бактериофаги имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50-60%, нуклеиновых кислот - 40-50%. Каждый Бактериофаги обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК).
Распространение. Бактериофаги найдены для большинства бактерий, в том числе патогенных и сапрофитных, а также.для актиномицетов (актинофаги) и сине-зелёных водорослей. Встречаются Бактериофаги в кишечнике человека и животных, в растениях, почве, водоёмах, сточных водах, навозе и т. д. Бактериофаги почвенных микроорганизмов влияют на течение микробиологических процессов в почве (денитрификацию, аммонификацию, азотфиксацию). Размножение. Бактериофаги прикрепляется своим отростком к бактериальной клетке и, выделяя фермент, растворяет клеточную стенку; затем содержимое его головки через канадец отростка переходит внутрь клетки, где под влиянием нуклеиновой кислоты фага останавливается синтез бактериальных белков, ДНК и РНК и начинается синтез нуклеиновой кислоты, а затем и белков фага. Часть этих белков - ферменты, другая часть образует оболочку зрелой частицы Бактериофаги Более мелкие, сферические фаги попадают в бактерии без участия отростка. Если клетка бактерии заражена одновременно частицами Бактериофаги, различающимися между собой по ряду свойств, то среди потомства, кроме частиц, подобных родителям, будут и такие, у которых эти свойства встречаются в новой комбинации, т. к. при размножении Бактериофаги наблюдается рекомбинация - обмен кусками нитей нуклеиновой кислоты, являющейся носителем наследственной информации. Частицы крупных фагов выходят из бактерии, разрушая её, а некоторых мелких и нитевидных - из живых бактерий.Одни Бактериофаги весьма специфичны и способны лизировать клетки только одного какого-либо вида микроорганизмов (монофаги), другие - клетки разных видов (полифаги).
Бактериофаги делят на вирулентные, вызывающие лизис клетки с образованием новых частиц, и умеренные (симбиотические), которые адсорбируются клеткой и проникают в неё, но лизиса не вызывают, а остаются в клетке в латентной (скрытой) неинфекционной форме (профаг). Культуры, содержащие латентный фаг, называются лизогенными. Лизогения передаётся потомству бактерии. Лизогенная культура может содержать 2-3 и более фагов; она, как правило, устойчива против находящихся в ней фагов (лишь небольшая часть клеток лизируется и освобождает зрелые фаги). Воздействуя на лизогенную культуру ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, перекисью водорода и некоторыми другими веществами, можно значительно увеличить количество клеток, освобождающих фаг (т. н. индукция Бактериофаги). Лизогения широко распространена среди всех видов бактерий и актиномицетов. В ряде случаев многие свойства лизогенной культуры (токсичность, подвижность бактерий и др.) зависят от наличия в ней определённых профагов. Описано много мутаций Бактериофаги, сопровождающихся изменением их литической активности, строения частиц и «колоний», устойчивости против неблагоприятных воздействий и другие свойств. Бактериофаги играют большую роль в изменчивости и эволюции микробов, причём механизмы воздействия их на клетку разные/ Бактериофаги могут резко изменять азотфиксирующую способность азотобактера, токсичность и антигенные свойства патогенных бактерий и др.
Практическое значение Бактериофаги Некоторые фаги (одни или в сочетании с антибиотиками) применяли для профилактики (фагопрофилактики) и лечения (фаготерапии) ряда бактериальных инфекционных болезней человека (дизентерия, брюшной тиф, холера, чума, стафилококковые и анаэробная инфекции и др.) и животных. Однако антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем применение их с лечебной целью сузилось. Бактериофаги успешно применяются при определении вида бактерий, актиномицетов. Бактериофаги могут вредить производству антибиотиков, аминокислот, молочных продуктов, бактериальных удобрений и в других отраслях микробиологического синтеза. Велико значение Бактериофаги для теоретических работ по генетике и молекулярной биологии

19) Классификация питательных сред и способы их получения. В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента, необходимого для его жизнедеятельности - дефицитной. Питательные среды классифицируют в зависимости от:v химического состава и исходных компонентов;консистенции;целевого назначения. В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред: среды неопределенного химического состава (естественные или натуральные среды) - это среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химических состав:1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.)2) среды растительного происхождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.)На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества, образующие микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. «Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ). Среды известного химического состава (синтетические) - в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и, исходя из этого, создать минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его размножения химические соединения. Поконсистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие. Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов. Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей - агар-агар или желатину.Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких -0,3-0,7%.Желатина - кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения. По целевому назначению различают:Общеупотребительные (основные) среды. Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.Мясная вода: Получение - мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч., затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям, плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120^ОС 20 мин.Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45^ОС, добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают, добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней.Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют автоклавированием при 120⁰С 20 мин.Мясо-пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃, фильтруют и через воронки разливают в пробирки, стерилизуют автоклавированием при120⁰ 20 мин.Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно автоклавированием при 120⁰С при 1 атм. течение 20 мин. Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют автоклавированием. Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят

20)) Cпирохеты — извитые подвижные бактерии, относящиеся к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae. Патогенные спирохеты принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema, Leptospira.Клетка спирохеты имеет цилиндрическую извитую форму, содержит цитоплазму, отграниченную цитоплазматической мембраной,, снаружи которой расположена клеточная стенка со слабовыраженным пептидогликановым слоем. Патогенные спирохеты имеют длину 3—20 мкм и толщину 0,1-0,5 мкм. Представители отдельных родов различаются по длине и толщине, числу и характеру завитков (табл. 2; рис. 21). Спирохеты грамотрицательны. Боррелии в отличие от трепо-нем и лептоспир хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Морфологию трепонем и лептоспир изучают путем микроскопии живых микроорганизмов в препаратах «раздавленная» или «висячая» капля в темнопольном или фазово-контрастном микроскопе, а также в мазках, окрашенных по Романовскому—Гимзе или специальными методами, например серебрениемМорфологию спирохет изучают в препаратах «раздавленная» капля и в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Нативные препараты микроскопируют в темном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа, наблюдая за активным и характерным движением спирохет и особенностями их формы.Приготовление мазков из крови. На чистое обезжиренное стекло ближе к одному из его концов помещают каплю крови. Другое предметное стекло, имеющее шлифованный край, прижимают под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвигают его к свободному концу первого стекла. При этом кровь распределяется по предметному стеклу тонким слоем. Высушивают препарат на воздухе, фиксируют в жидком фиксаторе (метиловый спирт или смесь этилового спирта и эфира).Для приготовления «толстой» капли на предметное стекло наслаивают 2—3 капли крови, распределяя ее до величины 10-копеечной монеты. После высушивания на воздухе осторожно наливают несколько капель дистиллированной воды на 10—15 мин для удаления гемоглобина из эритроцитов.Окрашивание препарата по Романовскому— Гимзе смесью метиленового синего, эозина и азура. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—20 мин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе. По Романовскому — Гимзе спирохеты возвратного тифа окрашиваются в фиолетовый цвет, эритроциты крови —в розовый, ядра лейкоцитов —в фиолетовый Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, лептоспиры —в розово-сиреневатый.

21) Чистая культура – это популяция микроорганизмов одного вида. Для выде­ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:1. Механическим разобщением бактериальных клеток;2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избира­тельное действие;3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме. Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе­мого материала.I этап.1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового мате­риала, засевают вторую и третью чашки.3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С.II этап.1. Микроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, ха­рактеру поверхности, краев, консистенции колонии.2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным ога-ром.4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап.Проверка культуры на чистоту (макроскопическим – однородный рост, микроскопическим- однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по:- ферментативным свойствам.- антигенным свойствам фагочувствительности токсигенности и другим признакам

22) Особенности морфологии м-мовСреди осн морф ф-м м-мов различ:

Шаровидные (кокки)

Палочковидные

Кокки по х-ру взаиморасположения дел на: