Антагонистическая активность дрожжей

Существующие методы определения антагонистической активности дрожжей можно разделить на две группы: методы in vitro и in vivo. В первой группе штамм-антагонист и тест-культура взаимодействуют в искусственных условиях внешней среды, а во второй - непосредственно в тех естественных условиях, в которых планируется эксплуатировать предполагаемый штамм-антагонист. В обзоре рассмотрены преимущества и ограничения этих методов. Антагонизм, дрожжей, методы in vitro и in vivo.

Так как термин in vivo касается только тех случаев, когда средой обитания микроорганизмов является организм хозяина, а примеры практического использования явления микробного антагонизма значительно шире, более справедливо делить эти методы на методы in vitro и in situ. Таким образом, методы in vivo можно рассматривать как частный случай методов in situ.На первых этапах исследования применяют в основном методы in vitro. Они позволяют отсеять не представляющие интереса неактивные или малоактивные штаммы. Дальнейшее исследование проводят с помощью методов in situ (in vivo), используя наиболее перспективные штаммы и препараты на их основе. Методы in vitro позволяют быстро проверить большой массив штаммов дрожжей и тест-культур нежелательных микроорганизмов. К данной группе относятся диффузионные методы и методы тестирования в жидких питательных средах. Диффузионные методы основаны на диффузии антибиотиков, образуемых испытуемыми штаммами лактобактерий, в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру, и подавлении роста последней. Согласно методу перпендикулярных штрихов на поверхности агаровой среды в чашке Петри высевают штрихом экспоненциальную культуру исследуемого штамма дрожжей и инкубируют при оптимальной для него температуре в течение определенного времени для образования и диффузии в агар ингибиторных соединений. Затем перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры дрожжей подсевают штрихом экспоненциальную культуру тест-штамма. Чашку вновь инкубируют, но теперь при условиях, благоприятных для роста тест культуры. О наличии и степени антагонистической активности у испытуемой дрожжей судят по величине зоны ингибирования тест-штамма на границе со штрихом роста дрожжей. На одной чашке к дрожжам можно подсеять несколько тест-культур и таким образом выявить спектр антагонистического действия данной дрожжей. Для объективной оценки антагонистического действия дрожжей, выявляемого этим методом, необходимо учитывать, что он дает преимущество штаммам, которые продуцируют ингибиторные соединения с небольшой молекулярной массой.

По методу перпендикулярных штрихов в чашке Петри на поверхности агаровой среды высевают штрихом культуру изучаемого штамма дрожжей, находящуюся на экспоненциальной фазе роста и инкубируют при оптимальной для него температуре в течение определенного времени, чтобы образовались ингибиторные соединения и диффундировали в агар. Далее перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры молочнокислых бактерий подсевают штрихом экспоненциальную культуру тест-штамма. Чашку вновь инкубируют, но при условиях, оптимальных для роста тест-культуры. О наличии и степени антагонистической активности у изучаемой дрожжей судят по величине зоны подавления роста тест-штамма на границе со штрихом роста дрожжей. На одной чашке к дрожжей можно подсеять несколько тест-культур и таким образом выявить спектр антагонистического действия данной дрожжей. Используемая агаровая среда должна обеспечивать хороший рост штамма дрожжей, а также тест-культур. Чтобы дать объективную оценку антагонистической активности дрожжей, изучаемой данным методом, нужно учитывать то, что метод дает преимущество штаммам, которые продуцируют ингибиторные соединения небольшой молекулярной массы, быстрее диффундирующих в толщу агарового слоя и, следовательно, дающих более обширные зоны подавления роста тест-культуры. Но у данного метода имеется недостаток: дрожжей и тест-штамм выращивают на одной среде, но среда может и не быть благоприятной одновременно для роста продуцента антибиотического вещества, образования антибиотика и для роста тест-культуры.

По методу лунок в слое агара, в котором содержится тест-штамм, пробочным сверлом вырезают лунку диаметром 5-7 мм и в нее помещают определенное количество жидкой или полужидкой среды с выросшей культурой исследуемого штамма дрожжей. Чашку Петри выдерживают в холодильнике, затем в термостате и измеряют зону ингибирования тест-штамма вокруг лунки. Методом лунок можно определить антагонистическую активность чистых и смешанных культур молочнокислых бактерий. Недостатком данного метода является возможность подтекания жидкости с культурой дрожжей из лунки в щель между агаром и дном чашки, что ведет к искажению результата. Избежать подтекания можно путем формирования лунки, не доходящей до дна чашки, используя при заливке чашки агаровой средой соответствующие шаблоны. Альтернативный вариант - применение двухслойного агара, при этом лунка вырезается только в верхнем слое.

Согласно методу блоков испытуемую культуру дрожжей высевают глубинным способом в питательный агар в чашке Петри и инкубируют в оптимальных условиях для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезают агаровый блок с выросшей культурой дрожжей и устанавливают его в другой чашке Петри на поверхности агаровой среды, только что засеянной культурой тест-штамма. Чашку выдерживают в течение определенного времени в холодильнике для диффузии ингибиторных соединений из блока в толщу агара с тест-штаммом, а затем инкубируют в условиях, оптимальных для тест-штамма. О степени антагонистической активности испытуемой дрожжей судят по величине зоны ингибирования роста тест-штамма вокруг агарового блока. В отличие от метода перпендикулярных штрихов, метод блоков дает возможность сравнить на одной чашке несколько штаммов дрожжей к данной тест-культуре. Кроме того, метод позволяет использовать разные по составу питательные среды: одну - для испытуемой дрожжей, другую - для данного тест-штамма. Кроме того, он удобен для изучения влияния состава питательной среды на продукцию ингибиторных соединений исследуемым штаммом дрожжей.

При методу агаровых слоев используют приемы, позволяющие разделить продукцию бактериоцинов от микроцинов. В первом случае на поверхность плотной питательной среды МРС-4 наносят бляшками и культивируют при температуре 37°С в течение 48 ч. Далее на крышку чашки наносят 5 мл хлороформа, оставляя чашки перевернутыми в течение 5 мин. Убитые в парах хлороформа бактерии помещают в термостат на 30 мин для испарения хлороформа. Затем на чашки наслаивают 0,7% полужидкий мясо-пептонный агар с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивируют при 37°С в течение ночи. Положительный результат учитывают по появлению вокруг бляшки зоны отсутствия роста. Преимущество данного метода - возможность дифференцировать продукцию бактериоцинов, а недостаток - высокая трудоемкость процесса.

Согласно методу капель на поверхность подсушенной агаровой среды наносят капли культур лдрожжей и после инкубации чашек Петри сверху агара наливают слой полужидкой агаровой среды, содержащей тест-штамм, и вновь инкубируют до появления зон ингибирования роста тест-штамма.

Н.А. Глушанова модифицировала метод капель следующим образом: суточную культуру пробиотика, выращенную на жидкой птательной среде, наносят на поверхность плотной среды в чашки Петри бактериологической петлей диаметром 2-3 мм и оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю суточной испытуемой культуры, выращенной на той же питательной среде. Растекаясь, вторая капля заходит на пятно культуры пробиотика примерно на половину диаметра. В наложенной части культуры развиваются при взаимном присутствии, конкурируя друг с другом. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капли второй культуры чашки с посевами инкубируют крышкой вниз при оптимальной температуре. Предварительный учет результатов проводят через 18-20 ч инкубации, окончательный учет - через 48 ч. Результат опыта учитывают визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой. Антагонистическую активность дрожжей оценивают по числу подавляемых ими штаммов тестируемых микроорганизмов. Этот метод представляет интерес, поскольку в данном случае, в отличие от диффузионных методов происходит непосредственное взаимодействие исследуемых культур.

Вариант диффузионного чашечного метода предложен Е.И. Заборских для выявления антагонистически активных клонов, образующихся после мутагенной обработки дрожжей. По этому методу серийные разведения мутагенизированных клеточных суспензий высевают на поверхность агаровой среды и после инкубации при условиях, оптимальных для данного штамма дрожжей, отбирают чашки, в которых количество выросших изолированных колоний не превышает 30. Методом реплик Ледерберга колонии с этих чашек переносят в чашки с плотной агаровой средой. Чашки-реплики инкубируют при оптимальных условиях для образования и диффузии в агар ингибиторных веществ, а затем опрыскивают взвесями клеток соответствующих тест-штаммов. После дополнительной инкубации чашек-реплик при условиях, оптимальных для тест - штаммов, с исходных чашек отбирают клоны, давшие на чашках-репликах наибольшие зоны ингибирования роста тест-штаммов. Этот метод по производительности многократно превосходит описанные выше диффузионные методы, однако его использование грозит опасностью загрязнения лаборатории взвесями тест-культур, что весьма ограничивает возможность его применения.

Согласно второй группе методов in vitro (методы тестирования в жидких питательных средах) тест-культуру выращивают в оптимальной для нее жидкой питательной среде, к которой добавляют определенное количество культуральной жидкости исследуемого штамма-антагониста, или тест-штамм совместно выращивают со штаммом-антагонистом.

Наибольший интерес представляет метод совместного культивирования молочнокислых бактерий с тест-организмами, поскольку он позволяет в естественной для молочнокислых бактерий среде определить их антагонистические свойства. Из инновационных методов выявления антагонистической активности дрожжей в жидкой среде следует обратить внимание на экспресс-тест, основанный на ингибировании биолюминисценции у специально сконструированного индикаторного штамма Escherichia coli lum+C-50. С помощью этого метода сравнивают антагонистическую активность зарубежных препаратов и новых отечественных комплексных пробиотиков. Анализ заключается в совместном 24 часовом культивировании испытуемого пробиотика с индикаторным штаммом при температуре 20°С с периодическим измерением интенсивности люминисценции с помощью люминометра «Биотокс-10М». Индекс антагонистической активности препарата выражается в виде цифрового показателя, соответствующего проценту снижения интенсивности свечения индикаторного штамма.

Методы изучения антагонистической активности микроорганизмов in situ являются наиболее трудоемкими, но и признаются наиболее объективными. К этим методам переходят после того, как опытным путем доказана антагонистическая активность того или иного штамма дрожжей в условиях in vitro.

Методы in situ могут быть осуществлены путем проведения опытных выработок, например, хлеба или кисломолочных продуктов с точным соблюдением всех параметров соответствующего технологического процесса, с использованием в закваске испытуемого штамма-антагониста при заданном исходном уровне заражения тест-микробом и учетом последующей численности этого тест-микроба в полуфабрикатах и готовом продукте. Они могут также заключаться в постановке опытных выработок продукта с использованием штамма-антагониста и статистическом учете численности естественной санитарно-показательной микрофлоры этого продукта в сравнении с контрольными выработками.

В свою очередь, методы in vivo предусматривают скармливание подопытным животным, инфицированным тест-микробом, штамма-антагониста с последующим выявлением тест-микроба в кале или прием пробиотических препаратов людьми при различных дисбиотических состояниях с последующим анализом качественных и количественных изменений в микрофлоре кишечника.

Данные методы используют при клинических испытаниях уже готовых пробиотических препаратов, бакконцентратов, заквасок и т.п. Применение этих методов позволяет не только выявить степень влияния штамма-антагониста и тест-штамма друг на друга, но и проследить их взаимодействие как с естественной кишечной микрофлорой, так и с организмом хозяина в целом. Организм животного или человека в данном случае - среда, в которой молочнокислые бактерии будут проявлять антагонистический эффект к тест- штамму. Здесь имеют место совокупность действий, многофакторность, комплексность условий, в которых происходит этот процесс, поэтому полученные результаты наиболее значимы для промышленного и медицинского применения антагонистически активных штаммов дрожжей.