Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПОЧВЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

 

 

1. Разработаны сотрудниками Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России, центра ГСЭН в Краснодарском крае.

 

2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н. Беляевым 24.12.2004.

 

3. Введены впервые.

 

Область применения

 

Настоящий документ является методической базой для осуществления государственного санитарно-эпидемиологического надзора за санитарным состоянием почв населенных мест, сельскохозяйственных угодий, территорий курортных зон и отдельных учреждений. Документ предназначен для лабораторий учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, а также лабораторий других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения указанных испытаний.

 

Нормативная ссылка

 

1.1. Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почвы. Санитарно-эпидемиологические правила и нормы. СанПиН 2.1.7.1287-03.

1.2. ГОСТ 17.4.3.01-83. Общие требования к отбору проб почвы.

1.3. ГОСТ 17.4.4.02-84. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа.

1.4. МУ 2.1.7.730-99. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест

1.5. МУ по санитарно-микробиологическому анализу лечебных грязей № 143-9/316-17.

1.6. МУК 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.

 

Санитарно-бактериологические показатели почвы и их нормирование

 

Санитарное состояние почвы - совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении.

Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от ее глубины. В поверхностном слое почвы (0 - 10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10 - 30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд. клеток на 1 г почвы), наименее - почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн. клеток в 1 г).

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:

1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это - санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм C. perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы - обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

Результаты анализов оцениваются в соответствии с таблицей № 1. Почву оценивают как "чистую" без ограничений по санитарно-бактериологическим показателям при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.

О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.

 

Таблица 1

Оборудование

Термостат для температурного режима (37 ± 1) °C

Баня водяная с подогревом до температуры 100 ± 2 °C

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом и устройство для создания разрежения (0,5 - 1,0) атм.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 1000 г и допустимой погрешностью ± 10 мг - ГОСТ 24104

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °C с ценой деления шкалы 0,5 °C

РН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды - ГОСТ 6709

Стерилизатор суховоздушный для температурного режима (180 ± 5) °C

Автоклав или стерилизатор паровой - ГОСТ 19569

Холодильник, позволяющий поддерживать температуру +2 - 4 °C

Облучатель бактерицидный

Горелка газовая или спиртовая

Петли бактериологические

Пинцеты для работы с мембранными фильтрами

Пипетки градуированные 1-го и 2-го классов точности вместимостью 1 см³, 5 см³, 10 см³ - ГОСТ 29227

Пробирки ГОСТ 25336-82

Чашки бактериологические (Петри) - ГОСТ 23932-90

Допускаются к использованию коммерческие, питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации отечественного производства, а также зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29000. При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

 

Подготовка и обработка почвы для анализа

 

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы.

Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито покрывают сверху стерильной бумагой. Почву дисперсную можно не подвергать просеиванию, почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке. Неперегнившую растительную массу отбрасывают.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1:9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 см³ стерильной водопроводной воды, 10 г почвы - в 90,0 см³ воды и т.д.). После приготовления разведений применяют соответствующую предварительную обработку почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель, которую преследуем, проводя предварительную обработку почвы, заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

Основными приемами предварительной обработки почвы являются:

1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками - при навеске почвы 1 г;

2) 3-минутная обработка почвенной суспензии первого разведения на мешалке механического диспергатора - при навеске почвы более 1 г.

Почвенную суспензию, содержащую в 1,0 см³ 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Дня этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г (10¹) отбирают стерильной пипеткой 1,0 см³ и переносят в пробирку с 9,0 см³ стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 г/см³ (10²) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001 - 0,00001 г/см³. (10⁴ - 10⁵). Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки.

Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

 

Подготовка фильтровального аппарата

 

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Следует начинать с фильтрования проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты, разлитую в стерильные чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Эта среда используется только при работе методом мембранной фильтрации. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °C в течение (24 ± 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие БГКП в исследуемой почве.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к БГКП.

Для подтверждения наличия БГКП исследуют:

- все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

- не менее 3 - 4 колоний каждого типа.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

- наличие оксидазной активности;

- принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

- ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Для расчета индекса количества бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме почвы, умножают на 1000 и делят на этот объем.

 

Определение энтерококков

 

Энтерококки - грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. Полиморфны. При росте на жидких средах (ЛПС - лактозо-пептонная среда, ЩЭС - щелочно-полимиксиновая среда) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

Подготовка проб и приготовление разведений указаны выше.

 

Титрационный метод

 

Из разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 см³ и засевают во флаконы с 50 см³ жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C 24 ч. Из порции среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных сред (МИС - молочно-ингибиторная среда, ЖСТ - желточная среда Турчинского). Если через 24 ч признаки роста отсутствуют, посевы оставляют еще на сутки. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

Через 24 - 48 ч инкубации посевов на молочно-ингибиторной среде при температуре (37 ± 0,5) °C в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний. Эта среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: Е. faecalis образует аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском, Е. faecalis биовар liguefaciens - такие же колонии, окруженные зоной просветления, Е. faecium биовар durans - серые, мелкие, плоские колонии.

Для подтверждения наличия энтерококков делают микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест. После выявления энтерококков устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

 

Метод мембранных фильтров

 

Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Выполнение анализа

Через мембранные фильтры профильтровывают 2 - 3 десятикратных объема испытуемой пробы. Фильтры с посевом помещают на азидную среду или среду ЖСТ и инкубируют при температуре 37 ± 0,5 °C в течение 24 - 48 часов.

Учет результатов на среде ЖСТ

Учет результатов на среде ЖСТ производят через 24 - 28 часов. Для учета выбирают фильтры, на которых выросло не более 20 - 30 колоний. Подсчитывают характерные для энтерококков колонии: плоские крупные с ровными краями, белые или бледноокрашенные с небольшим кремовым или розовым оттенком, а также малиновые. Последние образованы E. faecalis.

Если выросли колонии другого вида - выпуклые белые мелкие или ярко окрашенные, то их принадлежность к энтерококкам можно подтвердить по отсутствию каталазной активности и по характерной морфологии клеток при микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

Каталазный тест можно выполнить путем нанесения петлей капли 3%-ной перекиси водорода на подозрительные колонии. Более точно каталазный тест выполняют на предметном стекле, нанося петлей культуру и после подсушивания на воздухе добавляя каплю свежеприготовленной 3%-ной перекиси водорода и прикрывая покровным стеклом. Наличие пузырьков газа - положительный тест.

Учет результатов на азидной среде

Для учета выбирают фильтры, на которых выросло от 5 до 50 колоний.

Подсчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром.

Как правило, все колонии, которые растут на азидной среде, можно отнести к фекальным энтерококкам, имеющим индикаторное значение.

Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом), плоские разных оттенков колонии не учитывают.

При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 - 3 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по Граму.

При обнаружении в мазках грамположительных полиморфных диплококков дают положительный ответ.

Вычисление индекса энтерококков

Подсчитанное число колоний энтерококков суммируют и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Для расчета индекса количество колоний энтерококков суммируют, умножают на 1000 и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

 

Принцип метода

 

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

 

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ