Тема: физиология микроорганизмов.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

МЕТАБОЛИЗМ И ПИТАНИЕ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ (I и II этапы)

 

Цель занятия: изучить химический состав, процессы метаболизма и типы питания бактериальной клетки;познакомиться с питательными средами, освоить технику приготовления питательных сред; методы посева микробов на жидкие и твердые питательные среды; освоить технику забора исследуемого материала для микробиологического исследования; изучить этапы выделения чистой культуры аэробов и выделить чистую культуру.

Вопросы для обсуждения

1. Химический состав бактериальной клетки.

2. Роль бактерий в круговороте веществ в природе.

3. Катаболизм и анаболизм как составные части процесса метаболизма.

4. Питание бактерий. Источники питания микроорганизмов.

5. Классификация бактерий по типам питания. Понятие об аутотрофах, гетеротрофах, сапрофитах, абсолютных и факультативных паразитах, прототрофах, ауксотрофах.

6. Транспорт веществ в бактериальную клетку: энергонезависимый (простая и облегченная диффузия), энергозависимый (активный, транслокация радикалов).

7. Питательные среды, их классификация, характеристика

8. Требования, предъявляемые к питательным средам, этапы приготовления, контроль готовых сред.

9. Материал для бактериологического исследования.

10. Методы, правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала.

11. Выделение чистой культуры (1 день микробиологического анализа).

12. Методы (условия) культивирования микроорганизмов. Понятие об аэробах и анаэробах.

13. Методы и техника посевов для выделения чистой культуры.

Оформление протокола для лабораторного занятия

1. Записать в протокол номер, тему и цель занятия

2. Записать правила забора, хранения и транспортировки материала для микробиологического исследования

3. Нарисовать схему рис 7.3 «Механизмы транспорта через ЦПМ».

4. Составит и записать классификацию питательных сред.

5. Зарисовать или вклеить (на разворот в тетради) цветное фото схемы «Этапы выделения чистой культуры аэробов и анаэробов» (стенд из кабинета 207).

6. Зарисовать методы механического разобщения бактерий при посеве.

 

 

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Познакомиться с питательными средами. Записать схему их классификации по происхождению, консистенции, назначению.

2. Ознакомиться с методами и техникой посева на жидкие и плотные питательные среды.

3. Изучить этапы выделения чистой культуры микробов.

4. Приступить к выделению чистой культуры (1 день):

- Произвести забор материала из зева и носа и произвести посев отобранного материала на твердую дифференциально-диагностическую среду ЖСА для выделения культуры стафилококка.

- Приготовить мазок из нативного материала, окрасить синькой Лёффлера или по Граму, дать оценку микробного фона нативного материала, зарисовать.

- Записать ход исследования по выделению чистой культуры стафилококка (1-й день).

 

 

МАТЕРИАЛ К ИЗУЧЕНИЮ.

Этапы приготовления питательных сред

а) варка (согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необходимые компоненты и растворяют при нагревании);

б) установление рН с помощью потенциометра с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0,2 (для подщелачивания используют 0,1 н раствор NaOH, для подкисления - 0,1 н раствор HCI);

в) осветление среды с помощью яичного белка, лошадиной сыворотки или путем отстаивания (осаждения);

г) фильтрация через фильтровальную бумагу (жидкие среды) или ватно-марлевые фильтры (агаровые среды);

д) разливка питательных сред;

е) стерилизация;

ж) контроль готовых сред (стерильности, химический, биологический).

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов.

 

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде.

2. Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон – продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.

3. Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы. Источником азота может служить пептон. Большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота. Серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов. Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

4. Решающее значение для роста многих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных про­дуктов обмена. С этой целью питательную среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот, как продуктов обмена, добавляют к питательной среде карбонат кальция – СаO₂.

5. Среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавлением NaCl в концентрации 0,87%. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1%. Такие бактерии называются галофильными.

Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, то бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы и L - формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно раствор сахарозы.

При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы.

6. Питательные среды должны быть стерильными во избежание искажения результатов исследования.

Факторы роста микробов. У ряда микробов под воздействием ничтожно малых количеств ростовых веществ увеличивается накопление микробной массы и изменяется обмен веществ. По химической структуре и физиологическому действию стимуляторы являются подлинными витаминами или витаминоподобными веществами. Витамины или ростовые вещества играют главным образом роль катализаторов (ускорителей) биохимических процессов в бактериальной клетке. Они же являются структурными единицами при образовании некоторых ферментов.

Кроме витаминов, к факторам роста бактерий относятся пуриновые и пиримидиновыс основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Например, для гемолитического стрептококка фактором роста является аденин, для золотистого стафилококка — урацил, возбудителя столбняка — аденин или гипоксантин.

 

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть:

1 - жидкими;

2 - полужидкими;

3 - плотными.

Плотность среды достигается добавлением агар-агара.

· Агар-агар – полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100°С, но при охлаждении застывает при температуре 45-50°С. Агар добавляют в концентрации 0,5% – для полужидких сред и 1,5-2% – для создания плотных сред.

Назначение полужидких питательных сред – хранение музейных чистых культур микроорганизмов, а также для изучения их биохимических свойств (например, выделение газа), определение подвижности м/о.

Назначение плотных питательных сред - получение чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газонов), имеющих макроскопические размеры, для изучения их культуральных свойств.

В практике используют среды,различные по происхождению:

· натуральные питательные среды представляют собой неизмененные нативные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

· полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями переработанные нативные компоненты неопределенного состава – гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д.

· синтетическими питательными средами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Преимуществом синтетических сред являются их строго постоянный состав и воспроизводимость.

Приготовление питательных сред. Основой большинства питательных сред является мясная вода. Ее готовят из свежей нежирной говядины или конины. Мясо освобождают от фасций, связок, сухожилий, удаляют жир, нарезают мелкими кусочками или пропускают через мясорубку. Заливают двойным количеством воды и оставляют на 18-24 ч в прохладном месте. Затем фарш отжимают, а мясной экстракт кипятят на слабом огне в течение 40-60 мин. Фильтруют и доливают водой до первоначального объема. Разливают по колбам и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120^оС.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) готовят на мясной воде. К 1 л мясной воды добавляют 1% пептона, 0,5%NaCl. Кипятят до растворения пептона, помешивая. Устанавливают рН 7,2-7,6. рН среды доводят подщелачивая 10% раствором КОН или NаOH. После бульон кипятят в течение 5-10 мин и фильтруют через увлажненный дистиллированной водой бумажный фильтр. Среду разливают по пробиркам и стерилизуют в течение 20 мин при t=120^оС.

Мясо-пептонный агар (МПА). К МПБ добавляют 1,5-2% агар-агара. Агар-агар плавят в бульоне, доводя до кипения, устанавливают рН, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по флаконам в горячем виде и автоклавируют при 1 атм. 30 мин.

В настоящее время среды готовят из сухих питательных смесей, содержащих остатки продуктов рыбного, костно-мясного происхождения, гидролизаты кормовых дрожжей в соответствии с инструкцией.

По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные (селективные), дифференциально-диагностические,транспортные и консервирующие.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это пептические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду – питательный бульон (МПБ, бульон Хоттингера) и плотную – питательный агар (МПА, ГРМ-агар). Такие среды также служат основой для приготовления сложных питательных сред – сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, 1% пептонная вода, рН 8,0 для селекции холерного вибриона (щелочная реакция среды не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов);

желточно-солевой агар (ЖСА) содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8 – 10%), которые задерживают рост большинства микробов, не препятствуя при этом размножению стафилококков (для большинства микробов, включая патогенные для человека, концентрация соли 3%, лимитирует рост клеток).

Дифференциально-диагностические питательные среды применяют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред основан на различиях в биохимической активности бактерий разных видов вследствие неодинакового набора ферментов (среды Гисса, среда Эндо, Висмут-сульфит агар, Плоскерева, Левина, Олькеницкого, Клиглера, Расселя и др.).

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который является диагностическим признаком для данного вида, в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко используют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бактерий.

Транспортные и консервирующие среды применяют для времен­ного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого ма­териала и при транспортировке его в лабораторию. Обычно эти среды содержат только буферные и солевые растворы (иногда агар-агар, активированный уголь, твин-80 - для придания полужид­кой консистенции и нейтрализации токсических воздействий); они не предназначены для культивирования микробов (глицериновая смесь для бактерий семейства Enterobacteriaceae).

 

Исследуемый материал

↓↓↓

I этап (посев нативного материала)

Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).

Подготовка материала к исследованию.

Посев на среды обогащения и (или) на плотные селективные питательные среды

(получение изолированных колоний).

↓↓↓

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.