Анализ ОТ-ПЦР мРНК в генах bax и bcl-2, связанных с апоптозом — КиберПедия 

Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...

Анализ ОТ-ПЦР мРНК в генах bax и bcl-2, связанных с апоптозом

2017-09-29 294
Анализ ОТ-ПЦР мРНК в генах bax и bcl-2, связанных с апоптозом 0.00 из 5.00 0 оценок
Заказать работу

Чтобы дополнительно подтвердить влияние препарата JBP485 на подавление апоптоза у мышей, получивших Кон А, мы исследовали экспрессию генов bax и bcl-2, связанных с апоптозом, с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Общую РНК, экстрагированную в каждой группе, погружали в 1% агаровый гель. Можно ясно видеть полосы на уровне 28S, 18S и 5S, что подтверждает целостность общей РНК (Рисунок 6). При проведении ОТ-ПЦР 5 мкл продуктов ПЦР bax, bcl-2 и β-актина отделяли с помощью электрофореза и проявляли с помощью окрашивания этидия бромидом. Длина продуктов ПЦР bax, bcl-2 и β-актина составила 417 bp, 428 bp, 364 bp, соответственно (Рисунок 7а). Изменений в мРНК bcl-2 через 8 ч после введения Кон А не было, по сравнению с контрольной группой. Однако после лечения препаратом JBP485, уровень мРНК bcl-2 повысился, по сравнению с группой Кон А через 8 ч после введения Кон А (P<0,01) (Рисунок 7 b). Уровень мРНК bax в группе Кон А повысился, по сравнению с контрольной группой, однако значимых различий между группами Кон А и Кон А+ JBP485 (Рисунок 7 b). Соотношение между уровнем мРНК bcl-2/bax, которое определяет, будет ли происходить апоптоз, снизилось (Р<0,05) после введения Кон А. По сравнению с группой Кон А, соотношение между уровнем мРНК bcl-2/bax в группе Кон А+ JBP485 повысилось (Р<0,05) (Рисунок 7 с).

Рисунок 5. Влияние препарата JBP485 на фрагментацию ДНК в гепатоцитах при поражении печени, вызванном конканавалином А у мышей. Фрагментацию ДНК гепатоцитов исследовали с помощью электрофореза в агаровом геле. У мышей, получивших JBP485, отмечалось значительное снижение фрагментации ДНК. Полоса А – группа Кон А (10 мг/кг), полоса В – группа Кон А+ JBP485 (25 мг/кг), полоса С – контрольная группа, n=3 в каждой группе.

Рисунок 6. Влияние препарата JBP485 на общую РНК в гепатоцитах при поражении печени, вызванном конканавалином А у мышей. Полоса А – контрольная группа, полоса В – группа конканавалина А (Кон А), полоса С – группа JBP485, n=3 в каждой группе.

 

Обозначения

Normal Контрольная группа
Con A Кон А
Con A+JBP485 Кон А + JBP485
β-actin β-актин
bcl-2mRNA мРНК bcl-2
bax mRNA мРНК bax
Relative RNA Относительная РНК

Рисунок 7. Влияние препарата JBP485 на экспрессию мРНК генов bcl-2 и bax, вызванную введением Кон А, в гепатоцитах мышей. (а) Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) влияния препарата JBP485 (25 мг/кг) на экспрессию мРНК генов bcl-2 (слева) и bax (справа), вызванную введением Кон А. М – маркер. Полоса А – группа Кон А (10 мг/кг), полоса В – группа Кон А+ JBP485 (25 мг/кг), полоса С – контрольная группа. (b) Полуколичественный анализ продуктов ОТ-ПЦР. Данные денситометрической ОТ-ПЦР стандартизировали с сигналами β-актина. (с) Соотношение мРНК bcl-2 к мРНК bax. Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, n=3 в каждой группе. *Р<0,05 в сравнении с контрольной группой, # Р<0,05, ##Р<0,01 в сравнении с группой Кон А.

Обсуждение

Гепатит, вызванный приемом конканавалина А, у мышей и вирусный гепатит у людей имеют несколько схожих проявлений, в том числе воспалительную инфильтрацию, наличие ФНО-α, интерферона-γ и NO в сыворотке крови, признаки апоптоза, повышение экспрессии Fas, предполагаемое участие цитотоксических T-клеток.(10, 11) В целом, гепатит, вызванный Кон А у мышей, считается подходящей моделью для исследований терапии иммунно-опосредованного повреждения печени, в том числе повреждения печени вследствие вирусного гепатита у человека.

В настоящем исследовании мы показали, что препарат JBP485 оказывает защитное (гепатопротекторное) действие при иммунно-опосредованном гепатите, вызванном у мышей приемом препарата Кон А. Наши результаты показывают, что JBP485 значительно понижает в сыворотке крови уровень АЛТ и ЛДГ, которые указывают на повреждение клеточной мембраны. Кроме того, морфологическое исследование и анализ МПО позволяют предположить, что препарат JBP485 предотвращал повреждение печени, вызванное Кон А, а также воспалительную инфильтрацию у мышей.

Для дальнейшего исследования защитного механизма препарата мы определили активность СОД и продукцию МДА в тканях печени. Мы выявили, что JBP485 предотвращает снижение СОД и снижает уровень МДА в тканях печени мышей, получивших Кон А. Это позволило предположить, что после приема внутрь препарат JBP485 производит антиоксидантное действие, что частично объясняет защитное действие при экспериментально спровоцированном гепатите.

Мы также обнаружили, что препарат JBP485 способен понижать уровень нитрита в тканях печени мышей, получивших Кон А, что означает, что препарат JBP485 может ингибировать гиперэкспрессию NO, полученного из индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) в тканях печени (iNOS - одна из трех изоформ NOS, которую индуцируют цитокины (например ФНО-α и ИФ-γ), и которая может производить большое количество NO. Как показано в предыдущих исследованиях, повреждение печени, как и ее защита, связаны с NO.)12 Это защитное действие отмечалось при алкогольном гепатите, после частично гепатоэктомии а также после лечения GalN/ФНО-α или CCl 4. Гепатотоксический эффект экспрессии iNOS отмечался при геморрагическом шоке, ишемии/реперфузии, при наличии в крови эндотоксинов или после лечения GalN/липополисахаридами.(13) Гиперэкспрессия iNOS отмечалась при многих острых и хронических заболеваниях (например при септическом шоке, геморрагическом шоке и гепатите). Исследования показали, что чрезмерная продукция NO из iNOS играет важную роль в индуцировании токсического поражения печени.(6, 13) NO опосредует поражение тканей различными путями, в том числе путем ингибирования митохондриального дыхания, инактивации ингибиторов протеиназы и производства свободных радикалов.(14) В настоящем исследовании на мышах мы показали, что препарат JBP485 подавляет производство нитрита в тканях печени, по сравнению с группой Кон А, что означает, что механизм гепатопротекторного действия препарата JBP485 при гепатите, вызванном Кон А, включает ингибирование продукции NO, снижая, таким образом, токсичность для гепатоцитов у мышей, получивших Кон А.

ФНО-α – это центральный медиатор воспаления печени при гепатите, вызванном Кон А.(15, 16) Как недавно сообщалось, гепатит, вызванный Кон А, сильно зависит от ФНО-α, выделяемого звездчатыми эндотелиоцитами.(17) Доказано, что ингибирование ФНО-α антителами или растворимым рецептором-приманкой (decoy receptor) оказывает положительные терапевтический эффект на пациентов, страдающих от иммунно-опосредованных заболеваний, таких, как воспалительная болезнь кишечника или ревматоидный артрит.(9) В нашей модели гепатита, индуцированного Кон А мы исследовали терапевтическую эффективность препарата JBP485 у крыс и мышей с острым воспалительным поражением печени, вызванным приемом препарата Кон А.(3) Один из возможных механизмов противовоспалительного действия препарата JBP485 состоит в том, что он может ингибировать продукцию и секрецию ФНО-α, чтобы, в свою очередь, ингибировать миграцию Т-лимфоцитов, поскольку индуцирование иммунно-опосредованного поражения печени требует высвобождения и миграции активированных Т-клеток; препарат JBP485 может предотвратить это раннее событие в развитии повреждения печени, индуцированном Кон А. Другой механизм – непрямое ингибирование продукции NO и свободных радикалов, чтобы защитить гепатоциты от повреждения печени, индуцированного приемом Кон А.

Механизм действия препарата JBP485 при предотвращении повреждения печени, индуцированного приемом Кон А, также включает ингибирование экспрессии ICAM-1. Экспрессия ICAM-1 гепатоцитами связана с тяжестью воспалительного процесса в печени; гепатоциты экспрессируют ICAM-1 и молекулу адгезии сосудистой клетки-1 после стимуляции лимфокинами (например, ФНО-α), а затем Т-лимфоциты связываются с гепатоцитами через эти молекулы адгезии. Индуцирование и развитие воспаление требует адгезии лимфоцитов с клетками-мишенями. Кон А вызывает прямые биологические изменения в гепатоцитах, что приводит к повреждению печени активированными лимфоцитами.(18) Провоспалительное состояние – это ранний этап воспалительного каскада, который вызывает притяжение, адгезию и субэндотелиальную миграцию мононуклеальных клеток в печень.(16) Экспрессия адгезивных молекул – это важный этап развития проо-воспалительного состояния в эндотелиальных клетках. При поражении печени у мышей, вызванном приемом препарата Кон А мы выявили гиперэкспрессию ICAM-1, которая снижалась в группе, получавшей JBP485. Это означает, что препарат JBP485 может подавлять адгезию лимфоцитов с эндотелием и ингибировать миграцию лимфоцитов из кровеносного русла и проникновение субэндотелия.

Многие факторы могут ингибировать апоптоз гепатоцитов, например свободные радикалы, NO, ФНО-α.(14, 15, 19) Мы обнаружили, что препарат JBP485 значительно ингибировал фрагментацию ДНК, индуцированные Кон А. Чтобы определить точный молекулярный механизм ингибирования фрагментации ДНК препаратом JBP485, мы исследовали экспрессию генов bax и bcl-2, связанных с апоптозом, которые принадлежат к семейству генов bcl-2. Модуляция экспрессии семейства генов bcl-2 – это важный молекулярный механизм апоптоза клеток, который играет решающую роль при обычном апоптозе.(19) Биологическая функция белка bcl-2 – оказаывать защитное действие при воздействии факторов апоптоза, препятствует апоптозу и продлевает срок жизни; напротив, белок bax, который структурно очень напоминает bcl-2, содействует апоптозу семейства белков bcl-2.(19, 20) bax инактивирует bcl-2, связываясь с ним, образуя гетеродимер. Таким образом, соотношение мРНК bcl-2/bax – это ключевой фактор, определяющий, будет ли происходить апоптоз в клетках, которые подверглись действию многочисленных повреждающих факторов.(20) Наше исследование позволяет предположить, что препарат JBP485 может защищать гепатоциты от апоптоза, в основном, благодаря апрегуляции экспрессии гена bcl-2, увеличивая соотношение мРНК bcl-2/bax.

Выводы

Наши данные показывают, что препарат JBP485 оказывает гепатопротекторное действие при повреждении печени у мышей, вызванном препаратом Кон А. Механизм такого действия может объясняться 1) ингибированием экспрессии нескольких воспалительных медиаторов и цитокинов, 2) антиоксидантным действием, связанным с СОД и МДА, 3) действием против апоптоза гепатоцитов путем снижения фрагментации ДНК и апрегуляции экспресии гена bcl-2.

Заявления

Конфликт интересов

Автор (ы) заявляет (ют) об отсутствии конфликта интересов

Финансирование

Данная работа проведена благодаря гранту Национального фонда естественных наук Китая (№30672498) и технологического отдела Фонда естественных наук провинции Ляонин (№2004225003-6). Особая благодарность компании Джапан Байопродактс Ко Лтд за финансовую помощь.

Список литературы.

1. Liu KX et al. Human placental extract stimulates liver regeneration in rats. Biol Pharm Bull 1998; 21: 44–49.

2. Liu KX et al. Hydroxyprolylserine derivatives JBP923 and JBP485 exhibit the antihepatitis activities after gastrointestinal absorption in rats. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 510–515.

3. Wu JJ et al. Protective effect of JBP485 on concanavalin A-induced hepatocyte toxicity in primary cultured rat hepatocytes. Eur J Pharmacol 2008; 589(1–3): 299–305.

4. Tiegs G et al. A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. J Clin Invest 1992; 90: 196–203.

5. Okamoto T et al. Aminoguanidine prevents concanavalin A-induced hepatitis in mice. Eur J Pharmacol 2000; 396: 125–130.

6. Ksontini R et al. Disparate roles for TNF- a and Fas ligand in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol 1998; 160: 4082– 4089.

7. Ajuebor MN et al. C-C chemokine ligand 2/monocyte chemoattratant protein-1 directly inhibits NKT cell IL-4 production and is hepatoprotective in T cell-mediated hepatitis in the mouse. J Immunol 2003; 170: 5252–5259.

8. Hentze H et al. Depletion of hepatic glutathione prevents death receptor-dependent apoptotic and necrotic liver injury in mice. Am J Pathol 2000; 156: 2045–2056.

9. Wolf AM et al. The kinase inhibitor imatinib mesylate inhibits TNF- a production in vitro and prevents TNF-dependent acute hepatic inflammation. Proc Natl Acad Sci 2005; 102: 13622–

13627.

10. Kusters S et al. Interferon gamma plays a critical role in T-cell- dependent liver injury in mice initiated by concanavalin A. Gastoroenterology 1996; 111: 462–471.

11. Yoneda M et al. A novel therapy for acute hepatitis utilizing dehydroepiandrosterone in the murine model of hepatitis. Biochem Pharmacol 2004; 68: 2283–2289.

12. Li J, Billiar TR. Determinants of nitric oxide protection and toxicity in the liver. Am J Physiol 1999; 276: G1069–G1073.

13. Sass G et al. Inducible nitric oxide synthase is critical for immune-mediated liver injury in mice. J Clin Invest 2001; 107: 439–447.

14. Marshall HE et al. Nitrosation and oxidant in the regulation of gene expression. FASEB J 2000; 14: 1889–1900.

15. Mizuhara H et al. T cell activation-associated hepatic injury: mediation by tumor necrosis factor and protection by interleukin 6. J Exp Med 1994; 179: 1529–1537.

16. Bruck R et al. Allicin, the active component of garlic, preventsimmune-mediated, concanavalin A-induced hepatic injury in mice. Liver Int 2005; 25: 613–621.

17. Schumann J. Importance of Kupffer cells for T-cell-dependent liver injury in mice. Am J Pathol 2000; 157: 1671–1683.

18. Wang ZZ et al. Protection of Veratrum nigrum L.var. ussuriense Nakai alkaloids against ischemia-reperfusion injury of the rat liver. World J Gastroenterol 2007; 13: 564–571.

19. Gao H, Zhou YW. Inhibitory effect of picroside P onhepatocyte apoptosis. Acta Pharmacol Sin 2005; 26: 729–736.

20. Cheng BH et al. D - b -Hydroxybutyrate inhibits the apoptosis of PC12 cells induced by 6-OHDA in relation to up-regulating the ratio of Bcl-2/Bax mRNA. Auton Neurosci-Basic 2007; 134:38–44.


Поделиться с друзьями:

Архитектура электронного правительства: Единая архитектура – это методологический подход при создании системы управления государства, который строится...

Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...

История развития хранилищ для нефти: Первые склады нефти появились в XVII веке. Они представляли собой землянные ямы-амбара глубиной 4…5 м...

Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьше­ния длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...



© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!

0.032 с.