Принципы построения идентификационных схем.

Ознакомление с биоразнообразием бактерий означает тяжелое упражнение для памяти: множество усваивается на память, а система – по логике. Попытка создать морфо – физиологическую классификацию, наиболее удобную для практического применения в плане быстрой идентификации микроорганизмов, была предпринята американским Комитетом Берджи по систематике бактерий. Она привела к объединению организмов в искусственные группы не имеющие таксономического статуса и в тривиальном словоупотреблении часто обозначаемые по наиболее характерному роду или названию.

Опре­делитель подробно раскрывает только один ас­пект таксономии бактерий, а именно идентифика­ция бактерий, и предназначен специально для тех, кто занимается главным образом определением бактерий, не касаясь классификации (распределе­ние организмов по таксонам) или номенклатуры (наименование организмов).

Общий подход к решению задачи по идентификации микроорганизма включает следующие шесть этапов.

Этап 1. Особенности схемы идентификации бактерий

Особенно важно понимать, что схемы идентификации, приведенные в определи­теле, это не схемы классификации. Признаки, используемые для дифференциации различных организмов, часто мало связаны с главными свойствами, на основании которых выделяют так­сономические группы организмов.

Этап 2. Выделенный микроорганизм прокариот или эукариот?

Определитель служит для идентификации бактерий (прокариот). Следовательно, приведен­ные здесь схемы идентификации нужно исполь­зовать, если исследуемый микроорганизм — бак­терия, а не микроскопический эукариот (предста­витель плесневых грибов, дрожжей, водорослей или простейших).

Этап 3. К какой из основных категорий относится выделенный мною организм?

Для практических целей бактерии подразделяют на четыре основных категории.

I. Грамотрицательные эубактерии, имеющие кле­точные стенки

II. Грамположительные эубактерии, имеющие кле­точные стенки

III. Эубактерии, лишенные клеточных стенок

IV. Архебактерии.

Этап 4. К какой группе принадлежит вы­деленный организм?

Следующий шаг после определения основной категории бактерий состоит в том, чтобы уста­новить раздел определителя, где она рассмотрена. Для этого нужно обратиться к главе, которая содержит перечни групп внутри каждой основной категории и краткое описание особенностей бак­терий, относящихся к каждой группе.

Этап 5. К какому роду относится выделенный организм?

Для большинства групп в определителе приведены таблицы или ключи, где указаны признаки, позволяющие провести дифференциацию родов внутри группы.

Этап 6. К какому виду относится выде­ленный организм?

Описания большинства родов снабжены таблица­ми, с помощью которых можно дифференциро­вать виды внутри данного рода.

Схемы идентификации отличаются от схем класси­фикации, хотя внешне они могут быть сходными. Схема идентификации для данной группы орга­низмов может быть разработана только после то­го, как эта группа будет классифицирована (т. е. признана как отличная от других организмов). Схема основана на одном или более признаках либо на совокупности признаков, которыми все организмы данной группы обладают, а других групп — нет. Часто это совсем не те признаки, на которых построена классификация. Напри­мер, классификация может быть основана на данных гибридизации ДНК/ДНК, в то время как идентификация — на фенотипическом признаке, хорошо коррелирующем с генетическими особен­ностями. В общем, для построения схемы иден­тификации выбирают такие признаки, которые легко определить, тогда как признаки, используе­мые для классификации, часто требуют примене­ния сложных методов (например, если это гомо­логия ДНК).

Схема идентификации должна включать малое число признаков, в отличие от схемы классификации, для которой часто ис­пользуют большое число признаков, как напри­мер, в нумерической таксономии. Такие идеаль­ные качества схемы идентификации не всегда достижимы, особенно в отношении тех родов и видов, для характеристики которых не подходят традиционные физиологические или биохимиче­ские тесты. В этих случаях для точного опреде­ления могут потребоваться весьма сложные про­цедуры, такие как электрофорез клеточных бел­ков в полиакриламидном геле, анализ состава липидов, гибридизация нуклеиновых кислот.

Идентификация многих родов и видов не мо­жет быть основана всего лишь на немногих тестах, но только на их полном наборе. Одним из примеров этого служит семейство Enterobacteriaceae. Чтобы не было необходимости засевать большое количество разлитых по пробир­кам сред, разработаны и поступают в продажу разнообразные наборы для удобного и быстрого проведения многочисленных тестов. Такие набо­ры созданы для идентификации различных таксонов, в том числе для микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Разработка такого рода тестовых систем продолжается. К каждой системе фирма-произво­дитель прилагает графики, таблицы, системы ко­дирования, компьютерные азы данных и переч­ни признаков.

Новейший способ идентификации бактерий — это применение генетических зондов. Метод основан на определении специфического участка молекулы ДНК данного организма. Зонд представляет собой небольшой отрезок ДНК, нуклеотидная последовательность которого уникальна для данного вида или рода бактерий. В целях идентификации исследуют реакцию меченного флуоресцентным красителем, радиоизотопом или биотином зонда с денатурированной ДНК иссле­дуемого организма. Если ДНК организма содержит комплементарную зонду последовательность, произойдет ее связывание с ДНК зонда за счет спаривания комплементарных оснований. К на­стоящему времени имеются флуоресцентные зон­ды к генам рибосомных РНК, позволяющие про­водить определение живых микроорганизмов под микроскопом.

Необходимость применения стандартизованных методик и тестов. Одна из трудностей при разработке схем идентификаций состоит в том, что результаты тестов для установления тех или иных признаков могут сильно зависеть от величины инокулята, температуры и длительности инкубации, состава среды, соотношения поверхности к объему у сосуда, в котором проводят тест, и, наконец, от критериев, используемых для оценки реакции как положительной или отрицательной. Из-за этого результаты тестирования, полученные в двух разных лабораториях, часто не совпадают точ­но, тогда как в каждой из них получают хорошо воспроизводимые результаты. Поэтому слепое применение схемы идентификации без учета конкретных условий, использованных теми, кто ее разрабатывал (к сожалению, эти условия не всегда указывают), может привести к ошибке. В идеале желательно было бы стандартизиро­вать условия для тестирования различных при­знаков. Некоторую надежду дает возможность использования посту­пающих в продажу готовых тестовых систем, которые проходят строгую проверку качества сред и реагентов, однако, к сожалению, пока нет ни одного общепризнанного готового набора тестов для того или иного таксона. Поэтому при использовании схемы идентификации лучше всегда параллельно ставить для сравнения тесты со штам­мами, которые определены абсолютно точно (типо­вые или ссылочные штаммы, имеющиеся в национальных коллекциях культур), чтобы не сомневаться, что схема дает достоверные резуль­таты в вашей лаборатории. Весьма важно срав­нить признаки изолята, предположительно относящегося к данному виду, с признаками ти­пового штамма.

Необходимость разграничения «положительных» и «отрицательных» реакций

Некоторые тесты основаны на признаках, которые связаны с плазмидами или фагами. Такие признаки могут быть высокомутабильными и по­этому малопригодными для целей идентифи­кации. Даже тесты, основанные на немутабильных признаках, могут быть недостаточно пригодными для схем идентификации, поскольку не да­ют хорошей воспроизводимости результатов. В идеале тест должен давать воспро­изводимые результаты, однозначно положительные или отрицательные, без двусмысленных ответов. На самом деле таких тестов может не быть. Окраска организма по Граму может быть «грамвариабельной»; присутствие эндоспор у штамма, образующего их лишь в небольшом ко­личестве, бывает трудно определить путем окра­шивания или с помощью теста на устойчивость к нагреванию; при незначительном образова­нии кислоты из сахара возможен ошибочный вывод об отсутствии кислотообразования; ответ «слабый рост» трудноотличим от результата «отсутствие роста». Между тем, точное, хотя и произвольное определение, что есть «положительный» ответ и что есть «отрицательный», часто очень важно для того, чтобы тест был полезен в схеме идентификации.

Необходимость работы с чистыми культурами

Лишь немногие бактерии имеют настолько характерные морфологические особенности, что их можно идентифицировать без выделения. В большинстве же случаев, прежде чем пытаться определить организм по фенотипическим признакам, необходимо получить его чистую культуру. Новейшие методы идентификации при помощи генных зондов, часто с амплификацией в полимеразной цепной реакции, можно применять на смешанных популяциях. В настоящее время, однако, применение этих методов ограничено видами, важными для медицины.

Однократный отбор колонии с агаровой пла­стинки не обеспечивает чистоту культуры. Это особенно справедливо в случае использования селективных сред: часто в колонии или рядом с ней могут присутствовать жизнеспособные, но не растущие на этих средах сопутствующие организмы, которые будут пересеяны вместе с выделяемым организмом. По этой причине для завершающего этапа выделения предпочтительны неселективные среды, поскольку они позволят сопутствующим организмам образовать видимые коло­нии. Даже при использовании неселективных сред не следует слишком скоро пересевать по виду вполне четкие колонии; некоторые сопутствующие микроорганизмы могут быть медленнорастущими и давать видимые колонии только при длительной инкубации. Дополнительные сложности возникают, если бактерии окружены внеклеточной слизью либо образуют сеть из цепочек или нитей; в эти компоненты или структуры часто заключены сопутствующие организмы, которые трудно отделить. Так, сопутствую­щие организмы часто проникают в гелеобразные чехлы, окружающие клетки цианобактерий, что очень затрудняет получение чистых культур.

Обычно колонии из клеток чистой культуры, высеянной на плотную среду, похожи одна на другую, что и служит доказательством чистоты культуры. Хотя в общем это верно, существуют исключения, например в случае S->R-вариантов, а также вариантов, связанных с образованием капсул и наличием либо отсутствием пигмен­тации. Подобные варианты можно отобрать с помощью определенных сред, температуры или иных условий культивирования. Другой критерий чистоты культуры — это морфология: для чистой культуры обычно характерна высокая степень морфологического сходства клеток в окрашенных или влажных препаратах. Однако и здесь быва­ют исключения, что зависит от возраста культу­ры, используемой среды или других условий роста. Примерами служат образование кокковидных тел, цист и спор, а также плеоморфизм.