Выделение и изучение качественного состава нуклеопротеидов из дрожжевых клеток

ОПЫТ N 1. Получение нуклеопротеида из дрожжей.

Дрожжи богаты нуклеопротеидами рибозного типа. Нуклеопротеид можно извлечь из разрушенных клеток дрожжей при щелочной реакции раствора и осадить подкислением.

 

Приборы: 1) ступка с пестиком,

2) стакан или колба на 50-100 мл,

3) цилиндр на 100 мл,

4) центрифуга на 2500-3000 оборотов,

5) пробирки для центрифуги,

6) пипетки,

7) стеклянная палочка.

Реактивы: 1) дрожжи прессованные,

2) диэтиловый эфир,

3)стеклянный песок,

4) 0,4%-ный раствор NаОН,

5) 5%-ная уксусная кислота.

Ход работы:

5 г дрожжей помещают в ступку, добавляют 10 капель эфира и 10 капель воды. Вносят щепотку песка и тщательно растирают. К гомогенату приливают 30 мл раствора NаОН и продолжают растирание в течение 15 минут.

Содержимое ступки разливают в две пробирки для центрифуги (с помощью пробирки с делениями на 10 мл) поровну. Вес одной центрифужной пробирки с содержимым должен быть равен весу другой центрифужной пробирки с содержимым. Центрифугируют в течение 5 - 10 мин при 2500 оборотов.

Центрифугат из всех пробирок выливают, а осадок нуклеопротеида собирают со дна шпателем и переносят в круглодонную колбу для гидролиза.

ОПЫТ N 2. Гидролиз нуклеопротеида.

Эту реакцию можно осуществить путем кипячения нуклеопротеидов с 5%-ной Н₂SO₄ в течение часа. Нуклеопротеид при этом расщепляется на белок и нуклеиновую кислоту, которая распадается на отдельные мононуклеотиды, а затем отщепляются пуриновые основания (аденин, гуанин) и фосфорная кислота. Белок за это время также подвергается частичному гидролизу до низкомолекулярных полипептидов и аминокислот. В гидролизе последовательно можно определить белок, пуриновые основания, пентозу и фосфорную кислоту.

 

Приборы: 1) штатив с пробирками, 2) колба с обратным холодильником, 3) воронка с фильтром, 4) химический стакан на 100 миллилитров.

 

Реактивы:1) Н₂SO₄ 5%-ный раствор.

Ход работы:

Нуклеопротеид, полученный из дрожжей, переносят в колбочку для гидролиза и добавляют 15 мл 5%-ного раствора серной кислоты. Колбочку закрывают пробкой с обратным холодильником и осторожно кипятят в течение часа.

После охлаждения гидролизат отфильтровывают в химический стакан и используют для анализа продуктов гидролиза.

ОПЫТ N 3. Обнаружение простых белков с помощью биуретовой реакции

Приборы: 1) штатив с пробирками, 2) пипетки

Реактивы: 1) 10%-ный раствор NaOH,

2) 1%-ный раствор СuSO₄.

Ход работы:

В пробирку наливают 1 мл профильтрованного гидролизата, добавляют 1 мл едкого натра и 1 каплю сернокислой меди. Отмечают цвет раствора в пробирке и на основании этого делают вывод о наличие белка (наличие белка в растворе позволяет судить о том, достаточно ли полно прошел гидролиз нуклеопротеида). Вышеописанная реакция называется биуретовой.

ОПЫТ N 4. Обнаружение пентоз в гидролизате нуклеопротеида

Для того, чтобы обнаружить в гидролизате нуклеопротеида пентозы удобно пользоваться реакцией с жидкостью Фелинга (это одна из реакций окисления альдопентоз).

 

Приборы: 1) штатив с пробирками, 2) пипетки, 3) спиртовка.

Реактивы: 1) реактив Фелинга,

2) 10%-ный раствор NaOH.

 

Ход работы:

В пробирку наливают 0,5 - 1 мл гидролизата и нейтрализуют по универсальной индикаторной бумаге путем осторожного прибавления по капле из пипетки NaOH. К нейтрализованному гидролизату добавляют равный объем реактива Фелинга, пробирку встряхивают и нагревают. Отмечают цвет осадка в пробирке, который свидетельствует о наличие пентоз в исследуемом гидролизате.

ОПЫТ N 5. Обнаружение пуриновых оснований в гидролизате нуклеопротеида.

 

Сущность реакции сводится к образованию серебряных солей пуриновых оснований, которые выпадают на дно пробирки в виде осадка.

 

Приборы: 1) штатив с пробирками, 2) пипетки, 3) спиртовка.

Реактивы: 1) аммиачный раствор серебра.

 

Ход работы:

В пробирку наливают 2 мл гидролизата нуклеопротеида, добавляют 5-6 капель концентрированного аммиака до щелочной реакции (реакцию среды проверяют с помощью универсальной индикаторной бумаги). Затем приливают 0,5 мл аммиачного раствора серебра. Отмечают выпадение хлопьевидного осадка серебряных солей пуриновых оснований, который постепенно оседает на дно. При необходимости раствор можно слегка нагреть, чтобы отчетливее видеть выпадение осадка.