III. Спектрофотометрический метод.

I. БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД.

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Существуют две разновидности этого метода, различающихся по чувствительности: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе, а при другой (микрометод) - от 0,1 до 2 мг.

 

II. МЕТОД ЛОУРИ.

 

Метод основан на образовании окрашенных продуктов взаимодействия ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией. Метод характеризуется высокой чувствительностью (от 10 до 100 мг белка в пробе). На развитие окраски влияет присутствие многих веществ (например, сахароза в концентрации 10, сернокислый аммонний - 0,15, детергенты: ритон Х-100 в конц. 0.1-0.2% и ЭДТА в конц. 0.5нМ, аскорбиновая кислота и некоторые восстановители - компоненты буферных смесей/трис-буфер в конц. 0.01-0.4нМ). В связи с этим при построении калибровочного графика для этого метода в растворитель для стандартного белка надо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах.

Реактив Фолина содержит много компонентов, среди которых Nа₂WO₄ * 2H₂O, Na₂MoO₄ * 2 H₂O, Li₂SO₄, концентрированную соляную и фосфорную кислоты. В процессе приготовления этого реактива производят кипячение в течение 10 часов. Таким образом приготовление этого реактива является трудоемкой процедурой (пропись реактива см. в любом практикуме по биохимии в методе определения белка по Лоури).

 

III. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД.

Метод основан на способности ароматических аминокислот (три.,тир. и в меньшей степени фен.) поглощать УФ свет с максимумом 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в УФ области может сильно отличаться. Условно считают, что при концентрации "усредненного белка" в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в 1 см).

Определению белка в данном методе мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Измеряя оптическую плотность при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и при 280 нм, содержание белка рассчитывают с помощью номограммы.

Экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 нм и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией. Точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе.

Содержание белка можно также найти по формуле Калька на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм.

Содержание белка,мг/мл = 1,45 А280 - 0,74 А260

Реактивы:1. Стандартный раствор белка, с концентрацией 10 мг/мл

2. Сывороточный альбумин (задача 1)

3. Сывороточный альбумин (задача 2)

4. Биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄ * 5 H₂O и 0,6 г

(NaKC₄H₄O₆* 4 H₂O (виннокислый K-Na, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл дист. воды, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10 раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г KJ и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят реактив в парафинированной или полиэтиленовой склянке.)

 

ХОД РАБОТЫ:

Количественное определение белка в задаче №1.

В три пробирки налить по 1 мл исследуемого раствора(задача 1), содержащего 2-10 мг белка, прилить по 4 мл биуретового реактива, выдержать пробы в затемненном месте в течение 30 мин и колориметрировать на ФЭКе при 540 нм (фильтр 7)

Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, связывающего показания оптической плотности с концентрацией белка в пробах.

 

 

Изучение некоторых общих свойств ферментов

ОПЫТ 1.

Сравнительное действие неорганических катализаторов и ферментов.

Биокатализаторы и катализаторы, характерные для неорганического мира, различаются не по сущности катализа. Это различие состоит в том, что ферменты имеют более сложное строение, чем неорганические катализаторы, что и обеспечивает очень высокую степень их специфичности, большую чувствительность, активность и лабильность.

Приборы: 1. Штатив с пробирками.

2. Пипетки.

3. Водяная баня с термометром.

Реактивы: 1. 1%-ный раствор крахмала на 0.3%-ном растворе NaCl.

2. 10%-ный раствор HCl.

3. Раствор Люголя.

4. Разбавленная слюна.

Ход работы.

Перед началом работы готовят раствор разбавленной слюны. Для этого, ополоснув рот дистиллированной водой и выплюнув ее в раковину, набирают в рот дистиллированную воду повторно и держат ее во рту 2...3 мин. Качество приготовленной разбавленной слюны зависит от того, давно ли человек ел и голоден ли он. Желательно чтобы тот студент, который готовит слюну, за 0.5 часа до этого не курил и не жевал жевательную резинку.

В три пробирки наливают по 5 мл 1%-ного раствора крахмала. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды, во вторую- 1 мл 10%-ной HCl, а в третью- 1мл слюны. Содержимое про­бирок 1 и 3 размешивают и ставят на водяную баню при 38^ОС, а пробирку N^о2 - в кипящую водяную баню. Через 15...20 минут все пробирки вынимают из водяной бани, охлаждают и добавляют туда 1...2 капли раствора Люголя. В растворе Люголя содержится иод, в присутствии которого крахмал (не расщепленный) имеет синий цвет. Если в пробирке наблюдается фиолетовое окрашивание – это значит, что расщепление находится на первоначальном этапе, красновато-бурое окрашивание свидетельствует о более полном расщеплении крахмала. Буро-желтое - об окончательном расщеплении.

 

Полученные результаты заносят в следующую таблицу:

 

 

Nо пробирки	Субстрат	Катализатор	Окрашивание р-ра
	Крахмал Крахмал Крахмал	------- Соляная кислота Амилаза слюны

ОПЫТ 2.

Термолабильность ферментов

При реакциях, катализируемых ферментами, как при химических реакциях вообще, по мере повышения температуры растет реакционная способность. Но так как ферменты являются белками, которые при высокой температуре могут необратимо денатурироваться, то для ферментативного действия характерно, что повышение скорости реакции идет при повышении температуры до определенного значения, а затем, при дальнейшем повышении температуры скорость снижается. Температурный оптимум большинства ферментов животного тела близок к температуре тела и лежит в пределах 37...40^ОС. Особая чувствительность ферментов к температуре является одним из свойств, качественно отличающих эти биокатализаторы от неорганических катализаторов. При низкой температуре приостанавливается ферментативная деятельность. Этот процесс обратим.

Приборы: 1. Штатив с пробирками.

2. Стакан со льдом.

3. Спиртовка.

4. Водяная баня с термометром.

Реактивы: 1. 1%-ный раствор крахмала на 0.3%-ном растворе NaCl.

2. 10%-ный раствор HCl.

3. Раствор Люголя.

Ход работы.

В опыте используются 4 температурных режима (0^ОС, комнатная температура, 37^ОС, 80^ОС).

В четыре пробирки наливают по 5 мл раствора крахмала и добавляют по 2...3 мл разбавленной слюны. Перемешивают содержимое каждой пробирки и ставят первую пробирку в сосуд со льдом (0^ОС) и в морозильную камеру, вторую оставляют в штативе при комнатной температуре на лабораторном столе, третью и четвертую помещают в водяные бани при температуре 37 и 80^ОС. Значение всех температур во время опыта постоянно фиксируется. Через 10 мин пробирки, помещенные в баню, охлаждают и во все (4) пробирки добавляют 1...2 капли раствора Люголя. Отметить окраску растворов. Если теперь поместить пробирку N^о1 в водяную баню при 38...40 ^ОС на 10 минут, то произойдет гидролиз крахмала, что и покажет изменение цвета раствора. Таким образом, может быть показана обратимость тормозящего действия низкой температуры на активность фермента.

 

ОПЫТ 3.

Ход работы.

В семи пронумерованных пробирках приготавливают фосфатные буферные смеси с различным значением рН следующим образом:

 

РЕАКТИВЫ	Nо пробирки
М/3 NaH2PO4, мл M/3 Na2HPO4, мл	4.7 0.3	4.4 0.6	3.3 1.7	2.5 2.5	1.7 3.3	0.6 4.4	0.3 4.7
рН буферной смеси	5.6	6.0	6.5	6.8	7.0	7.9	8.1

 

Затем в семь других пронумерованных пробирок наливают по 5 мл свежеприготовленного 0.5%-ного раствора крахмала на 0.3%-ном растворе NaCl. В каждую из пробирок добавляют по 1 мл фосфатной буферной смеси и по 1 мл разбавленной слюны и ставят в водяную баню при 38...40^ОС.^.Через 3...5 мин из пробирки Nо4,берут несколько капель раствора и проводят реакцию с раствором Люголя, причем эту операцию повторяют несколько раз (через каждые 2 минуты) до тех пор, пока в пробирке Nо4 не произойдет полное расщепление крахмала (появляется желто-красная окраска). После этого в остальные пробирки добавляют по несколько капель раствора Люголя. Содержимое пробирок окрашивается в разные цвета в соответствии с глубиной ферментативного гидролиза крахмала.

Сделать вывод о том, какое значение рН является оптимальным для ферментов слюны (в данном случае ее амилазы).

ОПЫТ 4.

Ход работы.

В три пробирки помещают по 1 мл следующих растворов: в первую - дистиллированную воду, во вторую- раствор NaCl, в третью раствор CuSO₄. Во все пробирки наливают по 2 мл раствора крахмала и по 1 мл разбавленной слюны. Тотчас же пробирки одновременно помещают в водяную баню при 38^ОС и через 10...15 мин во все пробирки добавляют раствор Люголя. Наилучшее переваривание крахмала наблюдается в присутствии NaCl, являющегося активатором амилазы слюны. В присутствии ионов меди переваривание крахмала сильно заторможено или полностью отсутствует (CuSO₄ является парализатором амилазы слюны).

 

Лабораторная работа №3

Принцип метода.

Перекись водорода разлагается каталазой. Избыток перекиси водорода титруют перманганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2 KMnO₄ + 5 H₂O₂ + 3 H₂SO₄-- > 2 MnSO₄ + K₂SO₄ + 8 H₂O + 5 O₂

В опыте определяют количество оставшейся неразрушенной перекиси водорода, в контроле - общее количество взятой перекиси водорода (каталаза в контрольной пробе инактивирована кипячением).

Вычитая результаты опыта из результатов контроля, узнают количество разрушенной в определенный промежуток времени перекиси водорода, что позволяет судить об активности каталазы.

 

Оборудование: 1. Бюретки прямые на 50 и 100 мл (по 1 шт.)

2. Цилиндр на 10 мл

3. Ступка с пестиком

4. Конические колбы на 200-250 мл (2 шт.)

5. Технические весы с разновесами

6. Пипетка на 10 мл "вытяжка фермента"

7. Пипетка "H₂SO₄"

8. Кипящая водяная баня

9. Шпатель

10. Колба мерная на 100 мл

11. Воронка

12. Фильтровальная бумага

Материалы: 1. Свежий растительный материал (морковь или картофель)

2. 0.1н раствор Н₂О₂

3. 0.1н раствор KMnO4

4. 10%-ный раствор H₂SO₄

5. СаСО₃ (крист.)

6. Песок кварцевый

Ход работы:

 

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют.

В коническую колбу на 200 мл берут из бюретки 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0.1н раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшейся перекиси водорода.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл) К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0.1н раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества пе­рекиси водорода.

По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной пе­рекиси водорода. Согласно уравнению реакции между KMnO₄ и H₂O₂, 1 мл 0.1н раствора перманганата калия соответствует 1.7 мг перекиси водорода.

 

Пример расчета.

Из 1.25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл. На титрование опытной пробы затрачено 15.5 мл,контрольной-30.2 мл 0.1н раствора перманганата калия. Количество разложенной перекиси водорода в пробе эквивалентно 30.2-15.5=14.7 мл 0.1н раствора перманганата калия и, следовательно, равно 14.7*1.7=24.99 мг.

В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 мг перекиси водорода, а за 1 мин - 99.96/30=3.33 мг. Так как

1 мкмоль перекиси водорода составляет 0.034 мг, то в 1 г моркови присутствует 33.3/0.034=100 Е каталазы.

 

Лабораторная работа №4

Получение сахаразы из дрожжевых клеток. Специфичность действия ферментов.

 

Все разнообразные химические превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются с п е ц и ф и ч е с к и м и б е л к а м и.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и сравнительно при низкой температуре тела.

Изучение свойств ферментов, условий их действия, определение содержания ферментов в различных органах и тканях имеет большое значение для правильного понимания сложнейших процессов жизнедеятельности организма.

Одним из важнейших свойств ферментов является специфичность их действия в отношении определенного субстрата. Специфичность каталитических свойств ферментов проявляется в том, что фермент, как правило, действует лишь на определенное вещество. На строгую специфичность ферментов указывает и тот факт, что в случаях стереоизомерии определенный фермент катализирует расщепление только одного стереоизомера. Специфичность ферментов - их важнейшее биологическое свойство, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ.

В данной работе рассматриваются процессы расщепления ферментом сахаразой субстрата - сахарозы и расщепления крахмала ферментом - амилазой, которая содержится в слюне человека.

 

ОПЫТ 1

Экстракция сахаразы из дрожжевых клеток

Материалы и реактивы:

 

· Прессованные дрожжи– 10 г

· Гомогенизатор (ступка с пестиком)

· Кварцевый песок

· Вода дистиллированная

Ход работы

10 грамм сухих дрожжей поместить в ступку, добавить 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировать в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка для разрушения клеточных стенок. Затем фарфоровую ступку с гомогенизатом поместить в сушильный шкаф с температурой 60 ⁰Сна 30-40 минут.

По истечении указанного времени вынуть ступку, охладить, добавить 30 мл дистиллированной воды и растереть содержимое ступки до однородной массы.

Затем гомогенизат, для осаждения клеточной массы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная надосадочная жидкость – экстракт сахаразы.

 

ОПЫТ 2

Ход работы

В две пробирки берут по 1 мл экстракта сахаразы. Одну из пробирок нагревают до кипения, чтобы разрушить фермент. После охлаждения в обе пробирки прибавляют по 2-3 мл 2%-ного раствора сахарозы и ставят на водяную баню при 40^оС на 10-15 мин., после чего вынимают пробирки из бани, охлаждают. Добавляют в каждую 1мл реактива Фелинга. Верхний слой жидкости нагревают до кипения. Появление желтого, затем красного осадка указывает на наличие в пробе моносахаридов, т.е. на произошедшее расщепление сахарозы ферментом сахаразой.

 

ОПЫТ 3.

Ход работы.

Перед началом работы готовят раствор разбавленной слюны. Для этого, ополоснув рот дистиллированной водой и выплюнув ее в раковину, набирают в рот дистиллированную воду повторно и держат ее во рту 2...3 мин. Качество приготовленной разбавленной слюны зависит от того, давно ли человек ел и голоден ли он. Желательно чтобы тот студент, который готовит слюну, за 0.5 часа до этого не курил и не жевал жевательную резинку.

Берут четыре пробирки, в пробирки N1 и N3 наливают по 4-5 мл раствора крахмала, а в пробирки N2 и N4 по 4-5 мл раствора сахарозы. Затем в пробирки N1 и N2 приливают по 2 мл разбавленной слюны, а в пробирки N3 и N4 - по 2 мл раствора сахаразы.

Все пробирки помещают в водяную баню (Т=38^о-40^оС) на 10-15 минут, не забывая периодически перемешивать содержимое пробирок встряхиванием для лучшего взаимодействия фермента с субстратом. После указанного срока пробирки вынимают из бани и охлаждают.

Содержимое пробирок N1 и N3 разливают на две части (пробирки 1 и 1а; пробирки 3 и 3а).

А. ОБНАРУЖЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ.

В пробирки NN 1,2,3, 4 прилить 1мл реактива Фелинга и нагреть верхний слой. Появление желтого, а затем красного окрашивания указывает на наличие в растворе глюкозы. Результаты занести в табл.I (знаком "+" обозначив наличие в растворе глюкозы, знаком "- " - ее отсутствие).

Таблица I.

N про- бирки	Субстрат	Фермент	Наличие в растворе глюкозы
	Крахмал Сахароза Крахмал Сахароза	Амилаза Амилаза Сахараза Сахараза

Б. ОБНАРУЖЕНИЕ КРАХМАЛА

В пробирках NN 1а и 3а проводят качественную реакцию на крахмал для чего добавляют в каждую пробирку по 1-2 капли раствора Люголя. Результаты заносят в табл.II, обозначив наличие нерасщепленного крахмала в пробе знаком "+" и знаком "-" гидролизованный крахмал.

 

Таблица II.

N про- бирки	Субстрат	Фермент	Наличие крахмала в пробе
	Крахмал Крахмал	Амилаза Сахараза

На основе результатов эксперимента делают соответствующие выводы.

 

 

Лабораторная работа №5

Количественное определение - каротина в растительном материале методом распределительной хроматографии

Каротин относится к группе каротиноидов-желтых и оранжевокрасных пигментов, построенных из восьми остатков изопрена и имеющих общую формулу С₄₀Н₅₆.

Известно по крайней мере 5 изомеров каротина, которые обоз­начают буквами греческого алфавита. Все они биологически активны, так как при их расщеплении с участием воды в организме человека и животных образуется витамин А. Наибольшей биологической активностью обладает b-каротин. При расщеплении молекулы b-каротина с присоединением воды образуется 2 молекулы витамина А (С₂₀Н₂₅ОН). Каротин нерастворим в воде, но растворяется в некоторых органических веществах.

Принцип метода:

Каротин экстрагируют из растительного материала ацетоном, затем переводят в петролейный эфир и отделяют от других пигментов методом распределительной хроматографии на колонках с окисью алюминия. Количество каротина определяют колориметрически по интенсивности желтой окраски путем сравнения с раствором азобензола (или бихромата калия), стандартизованного по каротину.

Оборудование:

1.Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр

2.Ступка фарфоровая с пестиком

3.Воронка делительная

4.Колба Бунзена

5.Воронка Бюхнера

6.Колонки хроматографические- 2 шт

7.Колбы мерные на 50 и 100 мл

8.Колба коническая

Реактивы:

1.Карбонат натрия (крист.)

2.Оксид кальция (крист.)

3.Сульфат натрия безводный

4.Оксид алюминия с влажностью 4% (окись алюминия высушивают при 105^ОС и увлажняют по расчету, хранят в банке с притертой крышкой)

5.Петролейный эфир

6.Стандартный раствор азобензола или бихромата калия

7.Ацетон

Ход определения:

5-10 г измельченного свежего растительного материала растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Каротин распадается в кислой среде, поэтому при растирании добавляют немного Na₂CO₃ (все операции по экстракции и очистке каротина желательно проводить при рассеянном свете, в токе углекислого газа или азота).

Каротин экстрагируют ацетоном, повторяя растирание навески и экстракцию несколько раз (пока экстракт не станет бесцветным). Обычно используют 5- кратное (по отношению к навеске) количество ацетона. Все ацетоновые экстракты сливают в стаканы, а затем фильтруют при отсасывании. Фильтр промывают небольшим количеством ацетона и количественно переносят в делительную воронку.

Хроматографическое разделение экстрагированных пигментов на окиси алюминия проводят с использованием в качестве растворителя петролейного эфира. Поэтому необходимо, чтобы пигменты сконцентрировались в этом растворе. Чтобы перевести пигменты в петролейный эфир, в делительную воронку приливают 10-20 мл этого растворителя, добавляют для лучшего разделения несколько миллилитров воды и кристаллик хлористого натрия, воронку встряхивают и оставляют до полного разделения слоев. Нижний (водно-ацетоновый) слой сливают. Воду приливают несколько раз до полного удаления слоев ацетона.

Для обезвоживания раствор пигментов в петролейном эфире пропускают через колонку, наполненную безводным Na₂SO₄. Дальнейшее отделение каротина от сопутствующих пигментов проводят мето­дом адсорбционной хроматографии на окиси алюминия. Для этого на дно хроматографической колонки помещают ватный тампон толщиной около 1 см. Затем в колонку небольшими порциями вносят окись алюминия влажностью 4%, слегка постукивая по колонке стеклянной палочкой и уплотняя адсорбент. Высоту слоя адсорбента доводят до 7-10 см. После этого в колонку кладут слой ваты и вносят безводный сульфат натрия слоем 0.5 см. Раствор каротина в петролейном эфире медленно (со скоростью 60 капель в мин) пропускают через хроматографическую колонку при слабом разрежении. При этом надо следить, чтобы над поверхностью адсорбента все время был слой растворителя, так как каротин на воздухе окисляется. Затем через колонку пропускают чистый петролейный эфир до тех пор, пока весь

каротин, отделяясь от двух пигментов, в виде желтой полосы неперейдет в приемник. Промывание колонки заканчивают, когда выте­кающий растворитель станет прозрачным. Раствор каротина переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят петролейным эфиром до метки.

Содержание каротина определяют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 440 нм, сравнивая со стан­дартным раствором азобензола или бихромата калия.

Вычисление результатов:

 

Количество каротина вычисляют по формуле:

a*D1*V*100

Х= ------------,

D2*n

где Х - содержание каротина, мг/100 г

а - количество миллиграммов каротина в 1 мл, которому соответствует стандартный раствор (0.00235 мг, если был взят азобензол и 0.00416 мг, если был взят бихромат

калия)

D₁- оптическая плотность исследуемого раствора

D₂- оптическая плотность стандарта

V - объем раствора каротина, мл

n - навеска растительного материала, г

 

Лабораторная работа №6

 

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА И УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПИРОВИНОГРАДНОИ КИСЛОТЫ В КРОВИ И ТКАНЯХ

Ход работы

 

ОПЫТ №1. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости до проведения процесса культивирования дрожжей

Определение производят минимум в двух параллелях. Для исследования берут 1 мл свежеприготовленной культуральной жидкости (образец № 1), содержащему от 0,2 до 2 мкмолей неорганического фосфата, к нему добавляют 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл молибденовой смеси. Содержимое пробирок хорошо перемешивают.

Затем во все пробы добавляют по 1 мл рабочего раствора эйконогена, все снова перемешивают и помещают в водяную баню при 37°С на 10 - 15 мин (или оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 мин.). После этого раствор охлаждают и фотометрируют при 625 нм.

Содержание фосфата в пробе рассчитывают по калибровочному графику. Для построения графика проводят определение фосфора в стандартном растворе КН₂РО₄, беря различные его количества в пределах чувствительности данного метода, а именно от 0,2 до 2 мкмолей фосфата в пробе для колориметрирования (5 мл). По результатам фотометрирования стандартного раствора фосфата строят график зависимости интенсивности окраски от количества взятого вещества. По оси ординат откладывают значения (оптической плотности) по оказанию ФЭКа, а по оси абсцисс - количество фосфата в данной пробе. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.

Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией фосфора, по зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому при колориметрировании необходимо придерживаться определенных стандартных условий.

 

ОПЫТ №2. Определение содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости после проведения процесса культивирования дрожжей

 

Для определения концентрации неорганического фосфата в образце № 2 сначала производят удаление из него дрожжевых клеток. Эта процедура осуществляется с помощью центрифугирования с последующей фильтацией (см. выше).

После этой прпоцедуры из исследуемого раствора необходимо удалить белки, которые могут оказаться в культуральной жидкости. По этой причине определение фосфора в образце № 2 необходимо производить в два этапа.

 

2.1. Удаление белков из исследуемой жидкости

Белки из исследуемого раствора осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой, добавляя ее к раствору до конечной концентрации 2,5%. Раствор хорошо перемешивают, осадок белка удаляют фильтрованием или центрифугированием.

От трихлоруксусной кислоты можно освободиться путем повторного встряхивания раствора с 5 - 10-кратным объемом насыщенного водой эфира. Трихлоруксусная кислота переходит при этом в эфирную фракцию. После встряхивания и отстаивания эфир отсасывают водоструйным насосом.

Хлорную кислоту удаляют в виде калиевой соли (KClO₄), образующейся при нейтрализации раствора концентрированным КОН. После добавления КОН раствор хорошо охлаждают и осадок удаляют центрифугированием на холоде. Растворимость KClO₄ при 0°С очень мала.

Вместо процедуры по удалению кислот безбелковый раствор можно просто нейтрализовать щелочью. При этом необходимо определить конечный объем пробы.

 

2.2. Определение концентрации неорганического фосфата

Эта процедура происходит в соответствии с вышеизложенным (см. п.1).

 

ОПЫТ №3. Определение количества неорганического фосфата, потребленного дрожжевыми клетками в процессе культивирования

По калибровочному графику определяется количество фосфора в обоих образцах и по разнице между этими величинами рассчитывается количество фосфора, потребленного в процессе гликолиза.

 

Лабораторная работа №8

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ.

Лабораторная работа №9

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРАХМАЛА В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ

(по Х.Н.Починку)

Колориметрический метод определения крахмала, разработанный Х.Н.Починком, пригоден для анализа растительных объектов, содержащих значительные количества примесей (фруктозаны, декстрины), мешающих определению крахмала другими методами.

Принцип метода:

 

Крахмал растворяют в 80%-ном растворе азотнокислого кальция и осаждают его из полученного раствора иодом. В присутствии иодистого калия и азотнокислого кальция иод полностью осаждает крахмал в виде темно-синего соединения, содержащего от 14 до 16% иода. После этого полученный комплекс растворяют в едком натре, разбавляют до определенного объема и проводят реакцию с иодом в кислой среде. Оптическую плотность полученного раствора определяют при 580-610 нм и концентрацию крахмала в растворе находят по калибровочному графику.

Материалы: 1.Растительный материал

2.Стеклянный песок

3.Очищенный крахмал

 

Реактивы: 1.Са(NO₃)₂, 5-ти, 20-ти и 80-ти % растворы

2.0.5%-ный раствор иода в иодистом калии

3.0.1н раствор NaOH

4.1н раствор HCl

 

Оборудование: 1.Центрифуга

2.Ступка фарфоровая с пестиком

3.Колбы мерные на 50 (6 шт) и 100 мл (1 шт)

4.Весы

5.Колба коническая

6.Фотоколориметр

7.Пипетки

8.Воронка

9.Баня водяная

Ход определения:

Берут навеску растительного материала, в которой содержится 5-50 мг крахмала (10-100 мг муки зерновых и зернобобовых культур, 100-200 мг клубней картофеля, около 1 г свежих листьев растений). Навеску растирают в ступке с 5 мл 80%-ного раствора нитрата кальция, затем переносят в коническую колбу, смывая остаток 10 мл 80%-ного раствора нитрата кальция. После этого содержимое колбы кипятят при слабом нагревании 3-5 мин. При этом крахмал переходит в коллоидальный раствор.

После кипячения в колбу приливают 15-20 мл дистиллированной воды, содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют 2-3 мин при 4000-5000 об/мин и сливают обычно мутный от коллоидального состояния крахмала раствор в мерную колбу на 100 мл.

Колбу, в которой проводили кипячение, и осадок промывают 2-3 раза горячей водой порциями по 5-10 мл, центрифугируют и присоединяют центрифугат к основному раствору в колбе. Раствор в мерной колбе доводят водой до метки, перемешивают и используют для определения крахмала.

Из мерной колбы берут 10 мл полученного раствора, переносят в центрифужную пробирку, содержащую 2 мл 0.5%-ного раствора иода в иодистом калии, перемешивают и отстаивают 15 мин.

После этого центрифугируют, прозрачный раствор сливают, а осадок промывают 2 раза 5%-ным раствором нитрата кальция, содержащим 0.01% иода (непосредственно перед промывкой к 40 мл 5%-ного раствора нитрата кальция прибавить 0.75 мл 0.5%-ного раствора ио­да в иодистом калии). К промытому осадку иодокрахмального комплекса добавляют 10 мл 0.1н раствора едкого натра, перемешивают, переносят в обычную пробирку и погружают пробирку в кипящую воду на 5 мин для растворения осадка.

После растворения осадка раствор переносят в мерную колбу на 50 мл, прибавляют 0.3 мл 0.5%-ного раствора иода в иодистом калии, разбавляют дистиллированной водой приблизительно до 40 мл, прибавляют 2 мл 1н раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при 580-610 нм (желтый светофильтр) в кювете шириной 10 мм. Полученные результаты сравнивают с калибровочным графиком.

Построение калибровочного графика:

Точно 50 мг очищенного крахмала растирают в ступке с 3 мл 80%-ного раствора азотнокислого кальция, переносят в коническую колбу на 100 мл, промывая ступку 15 мл 80%-ного раствора азотнокислого кальция, и кипятят 5 мин. Раствор охлаждают, переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Из этого раствора, содержащего 1 мг крахмала в 1 мл, берут в центрифужные пробирки 1; 2; 3 и 4 мл, приливают во все пробирки до 5 мл 20%-ного раствора азотнокислого кальция, прибавляют по 2 мл 0.5%-ного раствора иода в иодистом калии и оставляют на 15 мин. После этого центрифугируют и осадок промывают 2 раза 5%-ным раствором азотнокислого кальция. Растворяют осадки в 10 мл 0.1н раствора NaOH при нагревании. Растворы переносят в мерные колбы на 50 мл, в колбы прибавляют по 0.3 мл 0.5%-ного раствора иода в иодистом калии, разбавляют дистиллированной водой до 40 мл, прибавляют по 2 мл 1н раствора HCl, доводят до метки и фотометрируют с желтым светофильтром. На основании полученных данных строят калибровочный график.

Вычисление результатов проводят с использованием калибровочного графика по формуле:

50*b*C

Х= ------------------,

10000*b₁*N

 

где Х - содержание крахмала, %

b - общий объем исследуемого раствора, мл

b₁- объем исследуемого раствора, взятый для осаждения

крахмала иодом, мл

С - концентрация крахмала в колориметрируемом растворе, мг/л

50 - объем окрашенного колориметрируемого раствора, мл

10000 - коэффициент для перевода миллиграммов крахмала в граммы и проценты

N - навеска растительного материала, г

Лабораторная работа №10

 

Ход работы

 

В центрифужную пробирку берут 100 мг клеточной массы дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, культивированных в течении четырех часов в соответствующей питательной среде и накопивших в клетках гликоген, добавляют 3 мл 30%-ного раствора КОН. Пробирки закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25 - 50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах (1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2,5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл свежеприготовленного раствора антрона, перемешивают, погружают на 10 мин в кипящую водяную баню,

Через 10 мин пробы охлаждают в бане с ледяной водой и развившуюся зеленую со слабым синеватым оттенком окраску фотометрируют при 620 нм (окраска стабильна при комнатной температуре в течение нескольких часов).

Параллельно с исследуемым раствором ставят контрольную пробу с дистиллированной водой.

Для расчета содержания гликогена найденное по калибровочному графику количество глюкозы (калибровочный график строится по глюкозе) делят на коэффициент 1,11, так как молекулярный вес глюкозного остатка в гликогене равен 162, а молекулярный вес глюкозы - 180 (180:162=1,11).

 

Построение калибровочного графика для определения концентрации гликогена в биологическом материале.

 

График позволяет определить количество глюкозы в пробе, по которому и ведется пересчет содержания гликогена.

 

Реактивы:

1. Антрон - 0,2%-ный раствор, приготовленный на 95%-ном растворе H₂SO₄.Раствор готовят в день определения.

2. Глюкоза - стандартный раствор (1 мл содержит 40 мкг глюкозы).

3. КОН - 30%-ный раствор.

 

Для построения калибровочного графика из стандартного раствора глюкозы готовят ряд разведений. В широкие пробирки, стоящие во льду, помещают по 2,5 мл исследуемых растворов, (от 10 до 100 мкг глюкозы в пробе), и при встряхивании приливают по 5 мл свежеприготовленного раствора антрона. Пробы тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню. Через 10 мин пробы охлаждают в бане с ледяной водой и развившуюся зеленую со слабым синеватым оттенком окраску фотом