Внутривидовая дифференциация возбудителя туляремии

На территории стран СНГ циркулируют и выделяются культуры голарктического подвида возбудителя туляремии F. tularensis subspecies holarctica, различающиеся по чувствительности к эритромицину (и другим макролидам). Для определения этого свойства используют диски с эритромицином, содержащими 15 мкг антибиотика. Эта концентрация антибиотика позволяет дифференцировать штаммы туляремийного микроба на два биологических варианта: биовар Iи II. Для определения принадлежности к тому или иному биовару готовят суспензию испытуемой культуры в концентрации 10⁹ м.кл./мл по оптическому стандарту мутности. 0,5 мл такой суспензии вносят на чашку с агаровой средой, равномерно распределяя по поверхности, после чего накладывают в центральную часть чашки диск с эритромицином. Чашку помещают в термостат при 37ºС.

Учет и оценку результатов производят через 1-2 суток. При посеве чувствительной к эритромицину культуры вокруг диска с антибиотиком обнаруживают выраженную зону задержки роста диаметром 2-3 см; при посеве культуры, резистентной к эритромицину, по всей поверхности чашки отмечается равномерный рост. [15]

Выявление антигенов возбудителя туляремии серологическими методами

Серологические методы диагностики туляремии включают реакции, направленные как на выявление антигенов туляремийного микроба (реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакции прямой иммунофлюоресценции (РИФ, прямой метод), иммуноферментный метод (ИФА), так и реакции, предназначенные для определения антител к возбудителю (кровяно-капельная, РА, РПГА, РПТГА, непрямой иммунофлюоресцентный метод, (далее – РИФ, непрямой метод), ИФА.

Исследованию серологическими методами подлежит материал, который вместо живых туляремийных бактерий содержит туляремийные антигены и не пригоден для бактериологического исследования (загнившие трупы грызунов, погадки хищных птиц, помет млекопитающих, субстраты нор грызунов, почва).

На наличие антител к туляремийному микробу исследуют сыворотки людей, добытых при эпизотоологическом обследовании территории.

Серологические исследования на туляремию проводятся в любой диагностической лаборатории после обеззараживания сыворотки добавлением мертиолята (1:10000) с последующим прогреванием при 56⁰ С в течение 30 минут.

Для обнаружения туляремийного микроба используется как прямой, так и непрямой методы иммунофлюоресценции, для обнаружения антител к нему – только непрямой метод.

Реакция иммунофлюоресценции

Относится к прямым серологическим методам исследования.При исследовании патологического материала от больных людей, а также из объектов внешней среды может быть эффективен прямой иммунофлюоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Для обнаружения туляремийного микроба применяют люминисцирующие туляремийные иммуноглобулины. В качестве объектов, подвергающихся исследованию на обнаружение туляремийного микроба у человека с помощью РИФ, могут быть мазки, приготовленные из содержимого кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемого слизистой глаза, а из объектов окружающей среды (смывы с поверхностей, воздух, сено, фураж, а также мазки-отпечатки из органов животных и насекомых-переносчиков туляремии).

Реакция иммунофлуоресценции в непрямом варианте может быть рекомендована как один из серологических методов определения антител в сыворотке крови людей, вакцинированных против туляремии или реконвалесцентов, а также для диагностики туляремии у людей. РИФ является высоко специфичной и достаточно чувствительной. Она проста в постановке, дает ответ в течение 1,5-2 часов и может служить методом экспресс-диагностики туляремии.

Техника постановки. Для остановки реакции необходимо предварительно приготовить предметные стекла с «пятнами» антигена на них. С этой целью на чистые обезжиренные предметные стекла следует нанести в виде отдельных очень небольших «пятен» взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма в концентрации 500млн туляремийных микробных клеток в одном мл, используя для этого вторую генерацию культуры, полученной при посеве содержимого ампулы коммерческой вакцины на свернутую желточную среду Мак-Коя. «Пятна» делают бактериологической петлей. На каждом предметном стекле следует разместить до 8таких «пятен» по 4 в два ряда, сохраняя при этом необходимый для дальнейшей работы промежуток между отдельными «пятнами» антигена. После подсушивания стекла с «пятнами» антигена фиксируют в течение 20минут в 96º этиловом спирте и подсушивают на воздухе при комнатной температуре. После фиксации препарата границу каждого «пятна» на стороне мазков следует отметить тонким срезом воскового карандаша в виде решетки. Такая решетка препятствует слиянию капель сыворотки в различных разведениях при дальнейшей обработке препарата.

Исследуемую сыворотку разводят физиологическим раствором до получения разведения: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 и 1:640. Стекла с «пятнами» антигена помещают во влажную камеру и на каждое «пятно» антигена наносят одну каплю соответствующего разведения исследуемой сыворотки. При этом следует строго следить, чтобы рядом расположенные капли различных разведений сыворотки не сливались между собой. В противном случае такие стекла бракуют. Для контакта антигена с исследуемой сывороткой стекла оставляют на 30 минут при 37ºС, после чего промывают в проточной воде или в нескольких сменяемых порциях физиологического раствора и подсушивают на воздухе. На полученный таким путем комплекс антиген-антитело наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека, взятую в рабочем разведении. Для этого в сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды, а затем физиологическим раствором рН 7,0 -7,2 доводят до рабочего разведения.

РИФ (непрямой метод) проводят во влажной камере, но при комнатной температуре(18-20ºС) в течение 20 минут, после чего люминесцирующую сыворотку стряхивают со стеком. Препараты промывают в течение 5-10 минут под проточной водопроводной водой или в нескольких порциях физиологического раствора при рН 7,2-7,4, подсушивают на воздухе, наносят каплю нейтрального глицерина (9 частей глицерина и 1 часть физиологического раствора) и накрывают покровным стеклом. Такой препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе. При большом объеме исследуемого материала можно микроскопировать препараты без предварительного заключения в глицерин под покровное стекло.

За титр исследуемой сыворотки принимают последнее разведение, которое обеспечивает бактериальной клетке специфическое свечение, оцениваемое на четыре креста и три креста. Разведение сыворотки, при котором отмечается слабое свечение бактериальной клетки, оцениваемое на два креста и один крест, не учитывают. При исследовании сыворотки больного диагностическим титром считают разведение не ниже 1:40, обеспечивающее яркую флуоресценцию бактериальных клеток.

Контролем служат два препарата, в одном из которых «пятна» туляремийного антигена обработаны человеческой сывороткой иммунной к данному антигену, а во втором – сывороткой, не содержащей антител к туляремийному микробу. Обе сыворотки следует брать в разведении 1:5. При последующей обработке таких препаратов люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека должно быть яркое специфическое свечение туляремийных бактерий, во втором – свечение должно отсутствовать. [30]