Методы дифференциации бруцелл

После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию.С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).

Проба с раствором трипафлавина (на стекле). На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро через 1-2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев.

Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Реакция термоагглютинации. 2-3 мл 1х10⁹ мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане при 90⁰С в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1 час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO₂, образование H₂S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу "Тб".

Дифференциация по образованию сероводорода.В качестве реактива применяют водный раствор уксусно-кислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1x8 см. Полоски затем просушивают. Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе(2x10⁹ мкл в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную поверхность печеночного агара (pH 6,8-7,2). Затем берут полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами ставят в термостат при 37⁰С. Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевомконца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.Результаты учитываются через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете темневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают. Для B.suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12-20 мм, для B.abortus (биовар 1) – около 5-7, B.melitensis (биовар 1), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение свинцовой бумажки. У штаммов B.neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5-8 мм. Культуры B.ovis и B.canis сероводорода не образуют.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок. Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды – агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин – 1:50000, тионин – 1:50000.

Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45-50⁰С агарастерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000. Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20-25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно одновременно засевать 4-6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4-6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37⁰С. Учет результатов проводят через трое суток инкубации.

Схема учета:интенсивный рост по всему штриху 4+; интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+; менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+; очень слабый рост по ходу штриха или отдельные колонии +.

Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками. Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор, pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.). Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида B.melitensis; б) контроль с эталонным штаммом B.abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37⁰С 18-20 часов, а затем в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20, но не менее чем на 2+.

Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биоваров бруцелл, находящихся в R-форме, для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере, pH 8,2-8,4.

Определение чувствительности культур бруцелл к фагу. Бруцеллезный фаг "Тб" избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод: питательную среду – 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25-30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18-20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.

Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета 1 x 10⁹ мкл в 1 мл, 0,4-0,5 мл из этой взвеси наливают на поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре 37⁰С. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной каплефага в концентрации по 10 x 10² корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро наклоняют и капли фага стекают по дорожке.

Учет результатов. Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке)"4+", лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки в виде сот "3+". Резко ослабленный рост и небольшое количество бляшек "2+", очень слабый лизис "+" иотсутствие лизиса "–" – результат отрицательный.

Оценка результатов.За положительный результат следует принимать лизис культуры минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве контроля рекомендуется включать референтные штаммы B.melitensis 16M, B.abortus 544 и B.suis 1330. [16]