Департамент здравоохранения города Москвы

Департамент здравоохранения города Москвы

Алгоритмы манипуляций

Для проведения

Практических занятий

ПМ 05: Проведение лабораторных гистологических исследований

Специальность: 060604 Лабораторная диагностика

Составлено в соответствии с Государственными требованиями к минимуму содержания и уровню подготовки выпускников по специальности: 060604 Лабораторная диагностика

Общая редакция: Кочерыжкина Н.А. – преподаватель высшей квалификационной категории ГОУ СПО МУ №4

АЛГОРИТМЫ ДЕЙСТВИЙ СТУДЕНТОВ

ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАДАНИЙ

ПМ 05: Проведение лабораторных гистологических исследований

1. Подготовка посуды и предметных стекол к работе

2. Приготовление фиксаторов

3. Фиксация материала

4. Промывание материала для удаления фиксатора (формалина)

5. Обезвоживание, уплотнение и заливка материала в парафин

6. Приготовление спиртов различной концентрации»

7. Разведение спиртов

8. Приготовление гистологических срезов

9. Устранение артефактов приготовления гистологических срезов

10. Уход за микротомом и микротомными ножами

11. Монтировка срезов на стекло

12. Приготовление адгезивной среды

13. Депарафинирование гистологических срезов (подготовка срезов к окраске)

14. Приготовление красящих растворов

15. Окраска гистологических препаратов

16. Обезвоживание и просветление препаратов

17. Заключение препаратов

18. Обработка материала при срочной операционной биопсии

19. Микроскопирование препаратов

 

Подготовка посуды и предметных стекол к работе

Оснащение: раковина с проточной водой, эмалированная посуда для замачивания и кипячения стекол, электрическая плита, вытяжной шкаф, эксикаторы, банкас широким горлом, пинцет, хлопчатобумажные салфетки, картонные коробки.

Реактивы: 2-3% раствор гидрокарбоната натрия, раствор моющего средства, смесь Никифорова,

Алгоритм действий:

- Сложить стекла в эмалированную посуду и замочить в теплой мыльной воде

- Прокипятить стекла в 2-3% растворе гидрокарбоната натрия

- Промыть в проточной воде в течение нескольких часов

- Протереть чистой хлопчатобумажной тканью

- Поместить в смесь Никифорова на несколько дней.

- Пинцетом извлечь стекла из смеси Никифорова

- Протереть чистой тканью

- Проверить качество обезжиривания: капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.

- Сложить в коробку

 

Приготовление фиксаторов»

Приготовление 10% раствора формалина

Оснащение: вытяжной шкаф, банкас широким горломи притертой пробкой

Реактивы: 1 л40% формальдегида, 100 гкарбоната кальция или магния.

Алгоритм действий:

- На дно широкогорлой банки насыпать 100г карбоната кальция или магния

- Добавить 1 л 40% формальдегида

- Перемешать и оставить на сутки

- Полученный нейтральный формалин разбавить водопроводной водой в соотношении 1:10

Приготовление раствора Карнуа

Оснащение: вытяжной шкаф, банкас широким горломи притертой пробкой,мерный цилиндр, пипетки

Реактивы: спирт 100%, хлороформ, ледяная уксусная кислота.

Алгоритм действий:

- В приготовленную емкость последовательно отмерить и добавить:

o 60мл 100% спирта

o 30 мл хлороформа

o 10мл ледяной уксусной кислоты

- Перемешать

- Использоватьфиксатор следует сразу после приготовления.

Фиксация материала»

Вариант 1. С использованием гистологических кассет

Оснащение: вытяжной шкаф, емкость с широким горлом, гистологические кассеты, плотная бумага, простой карандаш

Реактивы: 10% раствор нейтрального формалина

Алгоритм действий:

	ХХХ ХХХ
- Вырезанный кусочек материала поместить в кассету	- Подготовить бумажную этикетку. - простым карандашом написать порядковый номер, под которым материал зарегистри-рован в журнале	- Этикетку поместить в кассету

 

- Закрыть кассету (при этом должен раздаться щелчок).

- Поместите кассету с материалом в емкостьшироким горлом

- Добавьте фиксатор в объеме в 10-20 раз превышающем объем фиксируемого материала

- Если цвет фиксатора изменился после погружения в него кусочков ткани, необходимо немедленно сменить фиксатор.

- Закрыть емкость крышкой и оставить под вытяжкой на время, необходимое для фиксации.

Вариант 2.

Оснащение: вытяжной шкаф, емкость с широким горлом, марлевые салфетки, плотная бумага, простой карандаш

Реактивы: 10% раствор нейтрального формалина

Алгоритм действий:

- Налить фиксатор в подготовленную емкость

- Подготовить марлевую салфетку

- Подготовить бумажную этикетку: простым карандашом написать на ней порядковый номер, под которым материал зарегистрирован в журнале.

- Положить этикетку в центр салфетки надписью вниз

- Поместить на салфетку вырезанные кусочки материала

- Завязать салфетку

- Поместить материал в сосуд с фиксатором

- Если цвет фиксатора изменился после погружения в него кусочков ткани, необходимо немедленно сменить фиксатор.

- Закрыть емкость крышкой и оставить материал в вытяжном шкафу до конца фиксации

 

4. «Промывание материала для удаления фиксатора (формалина)»

Оснащение: раковина с проточной водой, банкас широким горлом, отводная трубка, марлевая салфетка

Алгоритм действий:

- Материал поместить в стеклянную банку

- Вставить резиновую отводную трубку

- Обвязать горлышко банки марлей

- Поместить банку в раковину, отрегулировать напор воды и оставить на 24-48 часов

 

Вариант 1.

Оснащение: фарфоровая ступка с пестиком, спиртовка, банка с притертой пробкой

Реактивы: сульфат меди, 96% спирт.

Алгоритм действий:

- Сульфат меди растереть в ступке до порошкообразного состояния

- Прокалить над спиртовкой, постоянно помешивая до полного испарения воды. При этом сульфат меди приобретает бледно-голубую окраску.

- Безводный сульфат меди засыпать в банку (1часть)

- Добавить 4-6 частей 96% спирта

- Плотно закрыть пробкой и взболтать

- Оставить сутки, периодически взбалтывая

- Если весь сульфат меди адсорбировал воду и вновь приобрел синюю окраску, спирт слить в новую банку, добавить безводный сульфат меди и перемешать. Процедуру повторяют до тех пор, пока сульфат меди не останется безводным.

Вариант 2.

Оснащение: термостат, фарфоровая ступка с пестиком, банка с притертой пробкой, прямоугольный лоток, бумага

Реактивы: сульфат меди, 96% спирт.

Алгоритм действий:

- Сульфат меди растереть в ступке до порошкообразного состояния

- Лист бумаги положить на дно прямоугольного лотка

- Распределить медный купорос тонким слоем на бумаге

- Поместить лоток в термостат при 56º С; периодически помешивать. При этом сульфат меди приобретает бледно-голубую окраску.

- Безводный сульфат меди засыпать в банку (1часть)

- Добавить 4-6 частей 96% спирта

- Плотно закрыть пробкой и взболтать

- Оставить сутки, периодически взбалтывая

- Если весь сульфат меди адсорбировал воду и вновь приобрел синюю окраску, спирт слить в новую банку, добавить безводный сульфат меди и перемешать. Процедуру повторяют до тех пор, пока сульфат меди не останется безводным.

 

Разведение спиртов»

Оснащение: мерный цилиндр, широкогорлые банки с притертыми пробками, таблица разведения спиртов.

Реактивы: спирт 96%, дистиллированная вода

Алгоритм действий:

- Изучить таблицу разведения спиртов и рассчитать необходимое количество 96% спирта и дистиллированной воды

- Отмерить в цилиндре необходимое количество 96% спирта и перелить его с подготовленную банку

- Отмерить мерным цилиндром требуемое количество дистиллированной воды и перелить ее в банку со спиртом

- Перемешать полученный раствор

Таблица 1

Вариант 1

Оснащение: столик для расправления и сушки срезов, предметные стекла, стеклянная палочка, химический стакан, пипетка, препаровальная игла, кисточка, маркер

Реактивы: дистиллированная вода, адгезивная среда*

Алгоритм действий:

- Включить столик для расправления и сушки срезов

- Взять в одну руку 5-6 чистых обезжиренных стекол в виде веера

- Стеклянной палочкой нанести адгезивную среду на каждое стекло

- Растереть адгезивную среду обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины

- Промаркировать стекла**

- Поместить стекла на столик

- Нанести пипеткой 3-4 капли теплой дистиллированной воды на край стекла, покрытый адгезивной средой

- Препаровальной иглой или кисточкой перенести приготовленные срезы с лезвия ножа микротома на каплю воды на стекле. Срез приклеивают на стекло блестящей, обращенной к ножу стороной.

- Препаровальной иглой расправить срез и правильно его сориентировать

- Оставить стекло на столике до полного испарения воды; частично расплавляющийся парафин обеспечит хорошую фиксацию среза на стекле

Вариант 2

Оснащение: водяная баня, термостат, предметные стекла, планшет, стеклянная палочка, препаровальная игла, кисточка, маркер, фильтровальная бумага

Реактивы: дистиллированная вода, адгезивная среда

Алгоритм действий:

- Водяную баню наполнить водой и включить для нагрева

- Взять в одну руку 5-6 чистых обезжиренных стекол в виде веера

- Стеклянной палочкой нанести адгезивную среду на каждое стекло

- Растереть адгезивную среду обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины

- Промаркировать стекла

- Срезы перенести препаровальной иглой или кисточкой с лезвия ножа на подогретую воду

- Подготовленным предметным стеклом выловить срез

- Удалить излишки воды фильтровальной бумагой

- Сложить стекла со срезами на планшет

- Поместить стекла в термостат до полного высыхания.

* в качестве адгезивной среды можно использовать как готовый желатиновыйадгезив для гистологических срезов, так и приготовленные самостоятельно растворы яичного белка с глицерином,и раствор сыворотки крови (см. тему «Приготовление адгезивной среды»)

** для маркировки стекол предпочтительно использовать лабораторный маркер для предметных стекол, устойчивый к воздействию ксилола, спирта, ацетона (А) или алмазный карандаш (Б).

(А) (Б)

Вариант 1. Приготовление смеси белка с глицерином

Оснащение: химический стакан, бюкс с притертой крышкой, воронка, фильтровальная бумага

Реактивы: яичный белок, глицерин, тимол

Алгоритм действий:

- Отделить яичный белок от желтка и поместить его в химический стакан

- Взбить яичный белок

- Профильтровать белок через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой

- Добавить равный объем глицерина и несколько кристаллов тимола

- Перемешать

- Хранить в холодильнике несколько месяцев

Вариант 2. Приготовление адгезивной смеси на основе сыворотки

Оснащение: бюкс с притертой крышкой, пипетки, мерный цилиндр

Реактивы: сыворотка крови, дистиллированная вода, 5% раствор формалина

Алгоритм действий:

- В приготовленную емкость последовательно отмерить и добавить:

o 15 мл сыворотки

o 5 мл дистиллированной воды

o 6 мл 5% раствора формалина

- Перемешать

- Хранить в холодильнике

13.«Депарафинирование гистологических срезов (подготовка срезов к окраске)»

Оснащение: вытяжной шкаф, высокие бюксы спритертой крышкой, термостат, фильтровальная бумага, коробка для хранения стекол.

Реактивы: ксилол, спирты различной концентрации (70%-100%), дистиллированная вода

Алгоритм действий:

- Поместить срезы в раствор КсилолаI на 3-5 мин можно в термостате при 37° С

- Перенести срезы в раствор КсилолаПна 3-5 мин

- Перенести срезы в раствор 100%Спирта

- Перенести срезы в раствор 96% Спирта 1-2 по 1-2 мин в каждом растворе

- Перенести срезы в раствор 70%Спирта

- Промыть срезы в дистиллированной воде

- Фильтровальной бумагой удалить остатки воды со стекол

- Сложить стекла в коробку

Вариант 1. Приготовление гематоксилина Эрлиха

Оснащение: весы, шпатель, мерные колбы, стеклянная палочка

Реактивы: гематоксилин, калийные квасцы, глицерин, ледяная уксусная кислота, 96% спирт, дистиллированная вода

Алгоритм действий:

- Приготовить навеску гематоксилина (2 г)

- Приготовить навеску калийных квасцов (3 г)

- Налить в колбу 100 мл 96% спирта и растворить в нем 2г гематоксилина

- Налить в колбу 100 мл дистиллированной воды и растворить в ней3 г калийных квасцов

- Смешать оба раствора

- Добавить 100 мл глицерина

- Влить 10 мл ледяной уксусной кислоты

- Накрыть сосуд марлевой салфеткой и оставить на свету не менее чем на 15 дней для окисления гематоксилина в гематеин.

Вариант 2. Приготовление кислого гематоксилина Майера (водный раствор)

Оснащение: мерная колба на 1 л, весы, шпатель

Реактивы: гематоксилин кристаллический, алюмоаммонийные квасцы, дистиллированная вода, йодат натрия, хлоралгидрат, лимонная кислота

 

Алгоритм действий:

- Налить в колбу 1000 мл дистиллированной воды

- Приготовить навеску из 50 г алюмоаммиачных квасцов

- Растворить квасцы в дистиллированной воде

- Приготовить навески гематоксилина кристаллического (1 г), йодата натрия (200 мг), лимонной кислоты (1 г)

- Последовательно добавить приготовленные навески к раствору квасцов

- Приготовить навеску хлоралгидрата

- Добавить хлоралгидрат к приготовленному раствору.

- Перемешать

- Профильтровать. Раствор готов к применению

 

Приготовление 1% раствора эозина

Оснащение: торсионные весы, шпатель, мерные колбы, стеклянная палочка

Реактивы: эозин, дистиллированная вода

Алгоритм действий:

- Приготовить навеску 100 мг эозина

- В мерную колбу налить 100 мл дистиллированной воды

- Добавить эозин

- Тщательно размешать.

 

Заключение препаратов»

Оснащение: планшет для стекол, препаровальная игла, покровные стекла, бумажные салфетки, стеклянная палочка

Реактивы: среда для заключения*

Алгоритм действий:

- Извлечь стекло со срезом из ксилола

- Удалить салфеткой остатки ксилола по краям стекла и с обратной стороны

- Положить стекло на планшет

- Нанести каплю среды для заключения на край среза
- Поставить у края капли покровное стекло под углом 45°, при этом заключающая среда должна растечься по краю покровного стекла - Придерживая препаровальной иглой свободный край покровного стекла, медленно опустить его на срез
- Оставить стекла в горизонтальном положении до полного высыхания заключающей среды

_____________________________________________________________________________

* В качестве монтирующих сред для заключения гистологических препаратов можно использовать готовые водорастворимые (а) и водонерастворимые (б, в) смеси акриловых смол или приготовить самостоятельно бальзам (пихтовый,канадский) и полистирол (см. тему «Приготовление оптически прозрачных сред для заключения препаратов»).

А Б В

«Приготовление оптически прозрачных сред для заключения препаратов»

Вариант 1. Приготовление бальзама

Оснащение: банка с широким горлом и притертой крышкой, термостат, стеклянная палочка

Реактивы: сухой бальзам(пихтовый, канадский), ксилол

Алгоритм действий:

- Кусочки сухого бальзама поместить на дно банки

- Залить бальзам ксилолом

- Поставить банку в термостат при температуре 37-40°С.

- Слить в другую банку,растворившуюся до консистенции жидкого меда, часть ксилола.

- Долить в первую банку новую порцию ксилола

- Хранить приготовленный бальзам в плотно закрытой посуде.

Вариант 2. Приготовление полистирола

Оснащение: банка с широким горлом, термостат, весы, мерная колба, мерная пипетка, стеклянная палочка

Реактивы: полистирол, ксилол, дибутилфталат

 

Алгоритм действий:

- Приготовить навеску из 100 г полистирола

- Поместить полистирол в банку с широким горлом

- Отмерить и налить в банку 100 мл ксилола

- Добавить 12 мл дибутилфталата

- Поместить в термостат при температуре 37°С на несколько часов, периодически помешивать

- Готовую смолу хранить в плотно закрытой посуде.

 

 

 

Вариант 1:Настройка микроскопа с осветительным зеркалом

Алгоритм действий:

- Установить источник света (настольную лампу) на расстоянии около 25 см прямо перед микроскопом.

- Нить лампы направить в центр зеркала с плоской отражающей поверхностью.

- Наблюдая в зеркало, спроектировать нить лампы в центр плоскости закрытой апертурной диафрагмы конденсора.

- Раскрыть апертурную диафрагму конденсора.

Вариант 2: Настройка микроскопа при работе с накладными осветителями ( типа ОИ- 32М)

Алгоритм действий:

- Снять зеркало с микроскопа.

- Установить в отверстие на основании микроскопа накладной осветитель ОИ- 32М.

- Положить светофильтр или матовое стекло в откидную оправу, расположенную под конденсором

Департамент здравоохранения города Москвы

Алгоритмы манипуляций

Для проведения

Практических занятий