Mikrofiltration der Magermilch und nachfolgende Ultrafiltration des Permeats

Durch Membranfiltration können Caseine und Molkenproteine in der Milch getrennt und auf-

konzentriert werden. Zur Aufkonzentrierung der Caseinmicellen wurde Magermilch bei 50 °C

im Crossflow-Verfahren mit niedriger transmembraner Druckdifferenz mikrofiltriert (Zirko-

nium-Oxid Membran, mittlere Porenweite 0,1 µm, Mikrofiltrationsanlage MFS-1, Alfa Laval,

Glinde). Anschließend wurde das Retentat der mikrofiltrierten Magermilch („Caseinlösung“)

mit destilliertem Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Das „gewa-

schene“ Retentat wurde pasteurisiert (Rosista Milcherhitzer (300 l/h), APV Deutschland

GmbH, Unna) und auf 4 °C abgekühlt.

Zur Herstellung einer Proteinlösung mit einem erhöhten Molkenproteinanteil wurde das Per-

meat der Mikrofiltration (s.o.) anschließend ultrafiltriert. Die Ultrafiltration erfolgte bei 50 °C

(Hohlfaser-Rohrmodul 10 kD, Ultrafiltrationsanlage UFS-1, Alfa-Laval, Glinde). Das Reten-

tat der Ultrafiltration („Molkenproteinlösung“) wurde mit destilliertem Wasser dreimal gewa-

schen. Das Retentat und Permeat aus der Ultrafiltration wurde pasteurisiert (Rosista Milcher-

hitzer (300 l/h), APV Deutschland GmbH, Unna) und auf 4 °C abgekühlt. Der Gesamt-

proteingehalt sowie die Anteile von Casein, Molkenprotein und NPN-Verbindungen des ultra-

filtrierten Permeats der Mikrofiltration („Molkenproteinlösung“) sind in Tabelle 4.8 (Kapitel

4.3.4) dargestellt.

Die Lagerung der mikrofiltrierten und ultrafiltrierten Milchproben erfolgte bei 4 bis 6 °C im

Kühlhaus.

Ultrafiltration der Magermilch

Magermilch wurde bei 50 °C ultrafiltriert (Hohlfaser-Rohrmodul 50 kD, Ultrafiltrationsanlage

UFS-1, Alfa-Laval, Glinde). Für die in Kapitel 4.3.3 beschriebenen Versuchsreihen wurde das

Retentat der ersten Versuchsreihe (V1) auf einen Gehalt von 8 %, und der zweiten Versuchs-

reihe (V2) auf 7 % aufkonzentriert. Bei V1 wurde der Proteingehalt des Retentats mit Hilfe

des Permeats auf 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 und 6,0 % verdünnt und in V2 erfolgte die Verdünnung des

Retentats auf Proteingehalte von 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 und 3,0 %.

Page 40

3.3

Untersuchung der Milchproben

Bestimmung der Zusammensetzung von Milch mit Hilfe der Infrarottechnik

Prozessbegleitend wurden die Protein-, Fett- und Trockenmassegehalte der Milchproben mit

einem Infrarotgerät (MilkoScan 50; Foss Electric, Hamburg) bestimmt.

Standardverfahren zur chemischen und physikalischen Analyse von Milch

Butyrometrische Bestimmung des Fettgehaltes, Messungen des Eiweißgehaltes (Stickstoffbe-

stimmung nach Kjeldahl, Faktor: 6,38), enzymatische Bestimmung des Lactosegehaltes, Be-

stimmung der Gesamtasche und des pH-Wertes erfolgten nach den Richtlinien VDLUFA,

Methodenhandbuch VI.

Dichte von Milch

Für die Messung der Oberflächenspannung, ist die Kenntnis der Dichte notwendig. Für die

Standardmilchprodukte wurde die Dichte bei der jeweiligen Aufschäumtemperatur anhand der

Tabelle von Kessler [1996] abgelesen. Zur Berechnung der Dichte (ρ) der Magermilchproben

mit unterschiedlichen Protein-, Lactose- und Salzgehalten wurde die Formel nach Walstra et

al. [1984] verwendet:

∑

χ

χ

ρ

=

ρ

x

X

(3-1)

Die Dichte der einzelnen Milchkomponenten bei 20 °C (kg/m–3):

ρw

20 = 998,2 (Wasser)

ρf

20 = 918,0 (Fett)

ρp

20 = 1400,0 (Protein)

ρL

20 = 1780,0 (Lactose)

ρS

20 = 1850,0 (Salze)

Page 41

3.3.4 Partikelgrößenverteilung

Durch die Analyse der Partikelgrößenverteilung von Milch kann die Effektivität der Homo-

genisierung beurteilt werden. Zudem kann die Partikelgröße einen Einfluss auf das

Aufschäumverhalten von Milch und die Schaumstabilität haben [Mulder & Walstra, 1974].

Die Partikelverteilung der Milchproben und der innerlamellaren Flüssigkeit wurde mit einem

Laserbeugungsanalysator (Coulter LS 230, Beckman Coulter, Krefeld) bestimmt. Der

Messbereich beträgt 0,04 µm bis 2000 µm. Dadurch können sowohl Fettkugeln (Rohmilch:

1-8 µm) als auch ein Teil der Caseinmicellen (20 bis 500 nm [Fox, 2003]) gemessen werden.

Die Messzelle des Laserbeugungsanalysators ist mit Wasser gefüllt. Die unverdünnte Probe

wird tropfenweise in das Gerät gegeben bis eine ausreichende Konzentration (mind. 45 %) zur

Messung der Probe vorhanden ist. Die in der Messzelle befindliche Probe wird mit einem

Laserstrahl durchleuchtet und der Laserstrahl durch die vorhandenen Teilchen gebeugt. Der

gemessene Beugungswinkel ist ein Maß für die Teilchengröße. Die Zahl der Teilchen wird

durch die Lichtintensität auf den Beugungsringen ermittelt. Des weiteren wird durch eine spe-

zielle patentierte PIDS-Technologie (Polarization intensity differential scattering) die Parti-

kelgrößen im Größenbereich zwischen 0,04 bis 0,4 µm bestimmt. Hierbei werden die Teil-

chen zusätzlich mit dem weißen Licht einer Wolfram - Halogen Lampe mit Wellenlängen von

450, 600 und 900 nm horizontal und vertikal bestrahlt. Die Erfassung der Lichtintensitäten

erfolgt durch 6 in unterschiedlichen Winkeln (70° bis 146°) angeordnete Detektoren. Aus den

unterschiedlichen Streulichtintensitäten können die Teilchengrößen berechnet werden. Zur

Auswertung der Daten wird zusätzlich ein Brechungsindex (1,47 für Milchfett) benötigt. Die

Messdauer betrug 90 Sekunden. Es erfolgten Doppelbestimmungen. In den einzelnen Kapi-

teln sind die Mittelwerte der Partikelgrößen der Doppelbestimmungen angegeben.

3.3.5 Viskosität

Die Viskosität der Milchproben wurde mit einem Rheometer (UDS 200, Physica Messtech-

nik, Stuttgart) bestimmt. Die Aufzeichnung der Messungen erfolgte mit Hilfe der Universal

Software US 200 (Physica Messtechnik, Stuttgart). Für idealviskose Fluide ist bei einer kon-

stanten Temperatur das Verhältnis zwischen der Schubspannung τ und der Scherrate γx eine

Materialkonstante. Die Definition der Scherviskosität lautet:

γ

τ

=

η

x

(3-2)

Gemessen wurde mit einem Kegel-Platte-Meßsystem im Rotationsversuch. Nach der Vor-

scherung (30 s) und der Ruhephase (60 s) wurden die Milchproben bei 50 °C mit einer Scher-

rate von 50 bis 1000 (s-1) auf- und absteigend (20 Messpunkte, pro Messpunkt 5 Sekunden)

Page 42

geschert (s. Abb. 3.1). Milch zeigt bei geringer Schergeschwindigkeit eine Abweichung vom

idealviskosen Bereich. Im linearen Bereich (Scherrate 800 bis 1000 s-1) wurde aus den ermit-

telten Messpunkten ein Mittelwert berechnet und dieser Wert als Viskosität bezeichnet

(s. Abb. 3.1). Es erfolgten Doppelbestimmungen. In den einzelnen Kapiteln sind die Mittel-

werte der Doppelbestimmungen angegeben.

Scherrate [s-1]

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

V

is

k

os

ität [m

P

a

*s

]

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

S

c

hubs

pannung [N/m

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Viskosität [mPa*s]

Schubspannung [N/m]

Messpunkte zur Auswertung

der Viskosität

Abb. 3.1: Bestimmung der Viskosität in Abhängigkeit der Scherrate

3.3.6 Oberflächenspannung

Die Bestimmung der dynamischen Oberflächenspannung der Milch erfolgte mittels der Pen-

dant Drop Methode in einer temperierten Messkammer bei 20 °C für 20 Minuten (Drop Shape

Analysis System 10 Mk2, Krüss, Hamburg).

Hierbei wurde ein Tropfen an einer Nadel aufgehängt. Die Tropfenkontur wurde mit einer

digitalen Kamera aufgenommen. Die Software DSA1 ermöglicht die Bestimmung der Grenz-

flächenform und des Vergrößerungsmaßstabes. Gemäß der Laplace-Gleichung ist die Druck-

differenz zwischen Innen- und Außenseite einer Grenzfläche umgekehrt proportional zu den

Krümmungsradien der Grenzflächensegmente. Durch zusätzliche Kenntnis der Dichtediffe-

renz (s. Kap. 3.3.3) der beiden an der Grenzfläche beteiligten Phasen kann durch Angleichen

der Laplace-Gleichung an die Tropfenkontur die Oberflächenspannung der Probe bestimmt

werden. Aus den Daten (3 Messpunkte pro Minute, Doppelbestimmung) wurde der Verlauf

der Oberflächenspannung in Abhängigkeit von der Zeit (dynamische Oberflächenspannung)

beobachtet sowie der Wert der Oberflächenspannung im Gleichgewicht bestimmt (Messpunkt

Page 43

nach 20 Minuten, s. Abb. 3.2). In den einzelnen Kapiteln sind die Mittelwerte der Doppelbe-

stimmungen angegeben. Die Wiederholgrenze der Methode beträgt ± 0,2 mN/m.

Messdauer [s]

Oberflä

c

h

enspann

ung [mN/m]

47,5

48,0

48,5

49,0

49,5

50,0

50,5

51,0

Oberflächenspannung

im Gleichgewicht

Abb. 3.2: Messung der dynamischen Oberflächenspannung und der Oberflächenspannung

im Gleichgewicht [mN/m]

3.3.7 Charakterisierung der Molmassen mittels Größenausschlußchromatographie

(FPLC)

Geräte:

FPLC-System (Pharmacia Biotech, Freiburg), bestehend aus Chromatographie-Controller

(LCC-500 plus), 2 Pumpen (P-500), UV-Monitor (UV-M), Fraktionensammler (Frac-100)

und Auswerteprogramm FPLC directorTM Version 1.10.

Chromatographische Parameter:

Superdex 200 HR 10/30 Säule (Ausschlußgrenze: 1,3 x 106, Pharmacia Biotech, Freiburg),

Puffer: 0,1 mol/l Tris; 0,15 mol/ l NaCl; 8 mol/l Harnstoff; pH 8,0; Flußrate: 0,3 ml/ min;

Laufzeit: 100 min; λ=280 nm.

Standards:

Dextranblau (2.000.000 g x mol-1), Thyroglobulin (669.000 g x mol-1), Catalase

(232.000 g x mol-1), Aldolase (158.000 g x mol-1), alle von Pharmacia Biotech, Freiburg, und

β-Casein (24.000 g x mol-1), Sigma Chemie, Deisenhofen.

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Durchführung:

Die Magermilchproben wurden mit dem oben beschriebenen Puffer 1: 6 verdünnt, über

Membranfilter (Porengröße: 0,45 µm) filtriert und in die Porenschleife (25 µl) eingespritzt. Es

wurden Doppelbestimmungen ausgeführt.

3.3.8 Orientierende Untersuchungen zur Bestimmung der Oberflächen-

hydrophobizität

Die Oberflächenhydrophobizität der Magermilchproben wurde nach der Methode von Lieske

und Konrad [1994] bestimmt. Grundlage dieser Methode ist die Annahme, dass nichtionische

Detergenzmoleküle bevorzugt an hydrophobe Proteine binden. Durch Messung der Extinktion

der Proben mit Emulgatorzusatz (Tween 80), im Vergleich zur Extinktion der Proben ohne

Emulgatorzusatz, kann die Oberflächenhydrophobizität berechnet werden.

Die Milchproben wurden mit einem 0,01 mol/l Phosphatpuffer (pH 6) auf einen Proteingehalt

zwischen 0,05 und 0,10 % verdünnt. Es erfolgte eine Dreifachbestimmung. 50 µl der Eiweiß-

lösung wurden jeweils in ein Röhrchen pipettiert und bei der Hälfte der Proben 50 µl Tween

80 (0,25 %) dazugegeben. Die mit Tween 80 angereicherten Proben wurden für

10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Proben wurden mit 2,5 ml gelöstem Farb-

stoff (BIO-RAD Protein Assay) aufgefüllt, umgerührt und 12 Minuten bei Raumtemperatur

stehen gelassen. In dieser Zeit bindet sich der Farbstoff an das Protein. Anschließend wurde

die Extinktion der Milchproben bei einer Wellenlänge von 595 nm im Spektralphotometer

(UVIKON 941 PLUS, Kontron Instruments, Neufahrn) gemessen. Als Nullprobe wurde

Phosphatpuffer bzw. Phosphatpuffer mit Tween 80 verwendet. Aus den gemessenen Extinkti-

onen wurden die Mittelwerte gebildet und mit folgender Formel die Oberflächenhydrophobi-

zität berechnet:

Reste]

[polare

Reste]

polare

[nicht

Reste]

polare

[nicht

100*

EoT

EmT

EoT

PH

+

=

−

=

(3-3)

EoT = Extinktion ohne Tween 80

EmT = Extinktion mit Tween 80

Page 45

3.4

Charakterisierung der Makrostruktur von Milchschäumen

Die Methodik zum Aufschäumen von Milch ist in Kapitel 4.2 beschrieben. Wenn nicht anders

beschrieben wurden die Proben bei 50 °C aufgeschäumt.

Zur Charakterisierung der Makrostruktur des Schaums wurden nach dem Aufschäumen der

Milchproben Analysen vorgenommen. Im folgenden Abschnitt sind die unterschiedlichen

Methoden beschrieben.

Drainage

Die Menge an Drainageflüssigkeit in Abhängigkeit von der Zeit ist ein Maßstab für die

Schaumstabilität. Zur Bestimmung der Drainageflüssigkeit wurde ein schaumgefüllter Glas-

kolben auf einen Trichter mit Glasfritte gesetzt (vgl. Abb. 4.2) und an einem Stativ befestigt.

Unterhalb dieser Vorrichtung wurde ein Erlenmeyerkolben auf eine tarierte Waage gestellt

und die Drainageflüssigkeit des Schaums aufgefangen. Die Gewichtsdaten wurden bis zu ei-

ner Standzeit von 5 Minuten abgelesen und in der folgenden Standzeit direkt auf einen Rech-

ner, der mit der Waage verbunden war, übertragen. Zur Berechnung der prozentualen Draina-

ge wurde folgende Formel verwendet:

100*

]g[

Masse

]g[

Masse

[%]

Drainage

Schaum

Drainage

=

(3-4)

Schaumdichte

Die Masse des Schaums wurde durch Wiegen des Glaskolbens ohne Schaum und mit einem

Inhalt von 200 cm³ Schaum bestimmt. Die Dichte wurde wie folgt berechnet:

³]cm[

Volumen

]g[

Masse

]ml/g[

Dichte

Schaum

Schaum

Schaum

=

(3-5)

Mit Hilfe der Schaumdichte kann durch folgende Formel der Aufschlag bzw. Overrun kalku-

liert werden:

Schaum

Schaum

Milch

[%]

Overrun

ρ

ρ

−

ρ

=

*100

(3-6)

Eine abnehmende Schaumdichte bedeutet einen zunehmenden Overrun.

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