Фаги-условное начало лизиса культуры-вида

Прошло более 65 лет, выявленные Whitehead et al. есть фаги инвазии как причины

Неудачно брожений в молочных продуктах (Уайтхед и Кокс, 1935). В Качестве Причины Инфекции

недостаточное Отопление Молоко или дезинфекции не выйдет даже сегодня

Ферментер или запись фаги по воздуху в основном нерешенных культуры в танки

Вопрос (Riemelt et al., 1996). Кроме того, Молоко брожений найти в крупных промышленных

Масштаб в 50.000 л вместо танков, которые по экономическим причинам, отчасти по нескольку раз в день

Daly, 1983) заполняются (. Не редко бывает такое пополнение осуществляется в фаги

Большой ферментер, которые в конечном итоге к лизису начальный культуры и к выходу из строя

Окисление вести деятельность.

Классификация Lactococcus -фаги в 12 вида осуществляется на основе

Морфологию и ДНК-гомологии и включает как литические, так и представители lysogene

(Jarvis et al., 1991). Эта таксономия позже была снижена на 10 видов (Jarvis et al.,

1995; Moineau et al., 1995a). Размер линейного фаги геномы с kohesiven Концы

составляет между 18 и 54 kb (Braun et al., 1989). Всемирные исследования показали, что

Нарушений у промышленного Молочного брожений в основном на представителей вида

936, P335 и с2 Jarvis et al связаны с (., 1991; Moineau et al., 1996; Moineau et

al., 1992). При виде 936 и с2 исключительно вирулентной представители известны. При

Вид P335 были определены как литические, так и lysogene фаги (Chopin et al.,

2001). Все три генетически не родственных групп имеют

двойной двухцепочечной ДНК-геном и долго, не-сократительный хвосты. Следовательно, они принадлежат

к семейству Siphoviridae. Те фаги морфо типа B1, на вид 936, P335

и BK5-T принадлежат, имеют небольшие изометрические головки и имеют морфологические

Сходство в фаг λ из E. coli и SPP1 из B. subtilis (Emond et al., 1998). Которые

под бактериофаги уникальные виды с2 имеет prolate головы и принадлежит к Морфотипу

Б2. Этот таксон с2-это единственная группа Lactococcus -фаги, которые от "International

Committee on Taxonomy of Viruses" как отдельный род Pringle, 1996) отмечен (.

Page 26

1. Введение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Морфо-

Тип

Вид Типа

Фага

Важные

Представители

Последовательности

Длина

Genbank

Литература

P008 СИД

sk1 (S)

bIL170 (S)

bIL41

φvi

bIL66

F4-1

Р2

Q7

Q42

P482 (S)

~ 29,7 КБ

28.451 ВР

31.754 ВР

10.170 ВР

3.204 ВР

2.681 ВР

2.404 ВР

3.353 ВР

940 ВР

940 ВР

940 ВР

NC_001835

AF009630

L35061

AF087814

AF090370

L35175

M37979

AF152407

AF152409

AF152408

(Loof et al., 1983)

(Chandry et al., 1997)

(Crutz-Le Coq et al., 2002)

(Паррейра et al., 1996b)

(Промывка IT OFF et al., 2000)

unpublished

(Bidnenko et al., 1995)

(Chung et al., 1991)

(Labrie et al., 2000)

"

"

эта работа

P335

P335

φr1t (S)

bIL285

bIL286 (S)

bIL309 (S)

ul36 (S)

TP901-1 (S)

Tuc2009 (S)

4268 (S)

φ31

φLC3

us3

~ 36,4 kb

33.350 ВР

35.538 ВР

41.834 ВР

36.949 ВР

36.798 ВР

37.667 ВР

38.347 ВР

36.596 ВР

3.516 bb

7.987 ВР

1.619 ВР

U38906

AF323668

AF323669

AF323670

AF349457

AF304433

AF109874

AF489521

AF022773

AF242738

M90423

(Braun et al., 1989)

(van Sinderen et al., 1996)

(Chopin et al., 2001)

"

"

(Labrie et al., 2002)

(Brondsted et al., 2001)

unpublished

unpublished

(Walker et al., 1998)

(Lillehaug et al., 1997)

(Platteeuw et al., 1992)

B1

BK5-T

BK5-T (S)

40003 bb AF176025

(Desiere et al., 2001)

Б2

с2

c6A

P001

c2 (S)

bIL67 (S)

ml3

Q30

Q38

Q44

eb1

~ 21,9 КБ

~ 20,2 kb

22.163 ВР

22.195 ВР

1207 миль ВР

800 bp

1.480 ВР

1.481 ВР

1.486 ВР

L48605

L33769

X16178

AF152414

AF152411

AF152412

AF152410

(Powell et al., 1985)

(Hertwig et al., 1997)

(Лубберса et al., 1995)

(Schouler et al., 1994)

(Ширман et al., 1994)

(Labrie et al., 2000)

"

"

"

Tab. 3. Lactococcus -фаги вида и их главным представителем.

(S) полная последовательность фаги генома существует.

Page 27

1. Введение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

В базах многочисленные части, хотя последовательности перечисленных выше фаги

хранение, полный последовательностей вида 936 быть только фаги sk1

(Chandry et al., 1994b) и bIL170 (Crutz-Le Coq et al., 2002). Для sk1 54 были, для

bIL170 63 ORFs определены. После заражения L. lactis через три sk1

различные участки ДНК-транскрипция, ранний, средний и поздний,

различают (Beresford et al., 1993; Chandry et al., 1994a). Как представитель вида P335

r1t, bIL285, bIL286, bIL309, ul36, TP901-1, Tuc2009 и 4268 были секвенированы

(Brondsted et al., 2001; Chopin et al., 2001; Labrie и Moineau, 2002; van Sinderen et al.,

1996). При с2-полный геном вида фаги из bIL67 и с2 находится перед (лубберса

et al., 1995; Schouler et al., 1994). Геномы содержат 39 или 37 ORFs и показывают

Нуклеиновых кислот на уровне 80% идентичности, прежде всего, путем делеции или вставки

прерывается. Это приводит к потере или приобретению соответствующих фаги

типичный ORFs.

Чтобы сбоя окисление деятельность фаги предотвратить, были обширные

Гигиена-разрабатывает концепции, которые под девизом "Hazard Analysis of Critical Control

Points" (HACCP) будут сгруппированы вместе (Ropkins и Beck, 2000). Принципам

"Good Manufacturing Practice" (GMP) относится пространственное разделение

Кислота будильник и производственной сферах, а также строительство завода по производству

с точки зрения упрощенной очистки (Coffey et al., 2001). Риск

Фаги загрязнения может быть уменьшен, если все устройства ежедневно с фаги-

неактивный лицензирующего химических веществ, таких как хлор и надуксусной кислоты Lembke быть очищены (и

Тойбер, 1981) и выращивании Vorkulturen или брожений по производству

Стартовых культур в фаги-ингибирующего СМИ происходит (Sandine, 1977). Они содержат

Фосфат и/или цитрат, который способен, по литические фаги развития

незаменимые divalent ионов, главным образом Ca2+ связать (Поттер и Нельсон, 1952).

Кроме того, спектры, обусловленные вращением стартовых культур с различными Фаги

увеличением высоко инфекционных фаги вида Durmaz можно предотвратить (а

Klaenhammer, 1995; Хаггинс, 1984). Непрерывный мониторинг производства

выступающие фаги могу объяснить, когда быстрая смена вымирающих

Пуск культуры требуется Hull, 1977) (. Поскольку эти меры являются но исторически расходов,

промышленность требует Нового-создание стартовых культур с широким

Фаги спектра резистентности.

Page 28

1. Введение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Цель работы

В последние годы в области секвенирования Генома и создание новых

молекулярно-биологических методов достигнутом прогрессе должны для в рамках этой работы

молекулярные гены используются столы характеристика нестабильной Творог брожений.

Сначала произошли изменения в составе популяции бактерий на примере

для изучения неустойчивой брожения для приготовления питательной творожной. Для этого необходимо

Флуоресцентная in situ -гибридизации целых клеток с помощью олигонуклеотидных зондов, которые против

rRNA направлены используются. Поскольку этот метод не делать

Отдельных изолятов требует, может есть условное анализа Популяции без культивации

Изменение состава Бактерий осуществляться.

Выявление ферментации соответствующих генов в основной популяции необходимо учитывать

о генетический потенциал различных стартовых культур. Для этого анализа

различные фаги устойчивость генов и молекулярных маркерных генов, приходят в первую очередь

во внимание, что в мрачной истории и вкус или запах молочного продукта

влиять на. Последнее от гены лактозы и цитрата веществ, например. Поскольку

они кодируются так же, как и многие фаги гены резистентности часто Плазмиды-это ваше доказательство

особый интерес. Сравнение процент заболеваемости этим

брожение соответствующие параметры в брожений с нормальным и нарушенным

Раздражающий ход должен сказать, является ли раннее обнаружение

Неудачно брожений с ДНК-аналитических методов.

Поскольку окисление нестабильных Творог ходе брожений в основном на фаги-условное

Лизис исходной культуры бактерий связано, должны Пуск и культуры

Брожения образцы на наиболее часто встречающиеся фаги вида 936, P335 и с2

будут изучены. Кроме того, из анализа должны сопровождаться неустойчивой последовательности

Брожений изолированных фаги P482 другие выводы на Взаимодействие этих

молекулярно-генетических маркеров в бактерии и фаги нестабильной популяции

Творог брожений.

Page 29

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Материал и методы

Для всех решений и опресненной с помощью системы сверхчистой воды (SG чистейшая вода)

очищенная вода с помощью проводимости < 0,5 мс/см3 используется. Химикаты были

если иное не описано в п. А.-качества или с молекулярно-биологической

Чистоты от фирм Merck, Sigma или Fluka получены. Кто из Агарозы происходил

Eurogentec, Taq-полимеразы от Pharmacia.

Растворы и буферы

Карбонатного Буфера 1 М NaHCO3/Na2CO3, pH 9,0

Лизоцим раствора 1 мг/мл лизоцим из куриного белка, 100 000 ед/мг в TE

3х PBS

390 мм NaCl, 30 мм Na2HPO4/Близко2PO4, рН 7,4

PFA-фиксирование решения para 2 г формальдегида, 16,6 мл 3 раза PBS, 30 мл, H2O, pH 7,2 - 7,4

X-фосфатного буфера 160 мм Na2HPO4, 40 мм Близко2PO4, рН 7,4

DAPI-раствор 1 мкг/мл 4,6-Diamidino-2-phenylindol-дигидрохлорида в Ч2O

Гибридизация раствор 0,9 М NaCl, 20 мм Tris-HCl, 0,01% SDS, 0-35% формамид

Промывочного буфера 1 100 мм Na2HPO4, 150 мм NaCl, 10 мм ЭДТА, 40 мм NaOH

Моющего раствора 2 20 мм Трис, 0,01% SDS, 5 мм ЭДТА, Y M NaCl

5x образец буфера, 100 мм ЭДТА, 20% Фиколл 400, 0,1% брома фенол синий,

0,1% Xylenxyanol, pH 7,3

TBE-буфере

89 мм Tris-Base, 89 мм борная кислота, 2 мм ЭДТА, pH 8,3

TE-буфера

10 мм Трис-HCl, 1мм ЭДТА, рН 8,0

SSC-буфер

150 мм NaCl, 15 мм Na3-Цитрат, pH 7,0

СМИ и постоянные отношения

Выращивания микроорганизмов

M17-средство для выращивания Lactococcus spec. (Терцаги и Sandine, 1975)

Выращивании L. lactis проба проводилась в соответствии с требованиями либо

Агар-панели или в 5 мл жидкой питательной среде на ночь в инкубатор (Heraeus) или

Шейкер инкубатор (коричневый Labtherm/Labshaker) при 28-30°с и 180 оборотов в минуту.

M17-носителя 0,5 г аскорбиновой кислоты, 5,0 г мясной экстракт, дрожжевой экстракт 2,5 г, 0,25 г MgSO4,

19,0 г Na-ß-glycero фосфат, 2,5 г Pepton из казеина, 2,5 г из Pepton

Мясо, 5,0 г Pepton из сои, Ч2O ad 1000 мл, pH 7,2

Page 30

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

GM17-носитель M17-носитель с 0,5% лактозы

LM17-носитель M17-носитель с 0,5% глюкозы

MRS-среды для выращивания Leuconostoc spec. (de Man et al., 1960)

Для культивирование Leuconostoc штаммов был в зависимости от назначения MRS

Носитель в качестве жидкого носителя или в виде пластин используются. Поддон выше произошло

Ночь в инкубатор или в шейкер инкубаторе при 25°C и 180 оборотов в минуту.

MRS-средний мясной экстракт 2,5 г, 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г Pepton из казеина, 20,0 г

Глюкоза, 2,0 g K2HPO4, 5,0 г ацетата натрия, 2,0 г диаммония-гидро-

gencitrat, 0,2 г MgSO4 x 7 H2O, 0,05 г MnSO4 x 4 H2О, 1 мл Tween 80,

Ч2O ad 1000 мл, рН 6,5

Стволовые учет и хранение

Для производства многолетних культур свежие ÜN были-после добавления культур

стерильным глицерином в соотношении 1:2 или 1:3 при -80°C хранить. В длительном тесте оказался

однако хранение штаммов в кисло падший, tyndalisierter молоко считается более стабильным. Для этого

культур в 1,5 мл стерильного 10% (w/v) лакмус молока или Обезжиренного молока (Oxoid)были

überimpft и при 30°C выдерживают. Для долгосрочного хранения культуры после были

2 ч инкубации при -80°C заморожены.