На показатель преломления и процент белка по Рейссу

 

№ п/п	Показатель преломле-ния	Сыворотка крови	№ п/п	Показатель преломления	Сыворотка крови
Отсчет по шкале	Белок в %	Отсчет по шкале	Белок в %
	1,33705		0,63		1,34612		5,90
	1,33743		0,86		1,34650		6,12
	1,33781		1,08		1,34687		6,34
	1,33820		1,30		1,34724		6,55
	1,33858		1,52		1,34761		6,77
	1,33906		1,74		1,34798		6,98
	1,33934		1,96		1,34836		7,20
	1,33972		2,18		1,34873		7,42
	1,34000		2,40		1,34910		7,63
	1,34,048		2,62		1,34947		7,85
	1,34086		2,84		1,34948		8,06
	1,34124		3,06		1,35021		8,28
	1,34162		3,28		1,35058		8,49
	1,34199		3,50		1,35095		8,71
	1,34237		3,72		1,35132		8,92
	1,34275		3,94		1,35169		9,14
	1,34313		4,16		1,35205		9,35
	1,34350		4,38		1,35242		9,57
	1,34388		4,60		1,35279		9,78
	1, 34420		4,81		1,35316		9,99
	1,34463		5,03		1,35352		10,20
	1,34500		5,25		1,35388		10,41
	1,34537		5,47		1,35425		10,62
	1,34575		5,68		1,35461		10,76

 

 

Определение чистоты гамма-глобулиновой фракции. Проводят электрофоретически. Для этой цели применяют боратный буфер (на 5 л буфера берут: борной кислоты – 43,414 г; NаОН – 14,0 г; концентрированную НСl –12,7 мл) и краситель, содержащий в 1 л 5 % уксусной кислоты, 2 г хлористого аммония, 10 г каломеля и 1 г бромфенол синего. Смесь оставляют на ночь при помешивании и фильтруют. Режим разгонки - 16-18 часов при силе тока 0,5 ма на 1см ширины бумажной ленты.

Определение стерильности препарата. Проводят путём высевов гамма-глобулина на питательные среды МПБ и МПА. Посевы выдерживают при 37⁰ С в течение 8 суток.

Определение безвредности препарата. Контроль на безвредность проводится с использованием лабораторных животных - морских свинок и белых мышей.

Морским свинкам весом 250-350 г вводят подкожно 3 мл, а белым мышам весом 15-20 г - 0,5 мл гамма-глобулина. За животными наблюдают 5-7 дней. За это время у морских свинок не должно быть воспалительных реакций на месте введения препарата, мыши должны оставаться здоровыми.

Контроль на специфичность. Проводят в случаях получения специфического иммунного гамма-глобулина. Проводится так же, как и контроль соответствующей иммунной сыворотки. Дозы гамма-глобулина берут в 5-10 раз меньше доз исходной сыворотки.

Для определения специфичности гамма-глобулина проводят реакцию агглютинации на стекле, используя в качестве антигена микроорганизм, антитела против которого должны находиться в препарате. При положительной реакции образуются хлопья, следовательно гамма-глобулин обладает специфичностью.

Также вводят белым мышам подкожно 0,01 мл гамма-глобулина и 500 млн микробных клеток возбудителя. Если изменений в общем состоянии животных не наблюдается, препарат является специфичным.

Хранение гамма-глобулина и срок годности.

Гамма-глобулин должен храниться при температуре 4⁰-10⁰ С. Срок годности гамма-глобулина - 1,5-2 года с момента изготовления препарата.

 

Получение гамма-глобулина на биопредприятиях

 

Как упоминалось выше, иммуноглобулины выделяют из гипериммунных сывороток.

Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринированием плазмы. Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путём удаления форменных элементов и фибрина, называются нативными в отличие от сывороток, подвергнутых дополнительной очистки и концентрации специальными методами.

Но прежде чем приготовить сывороточные и глобулиновые препараты, необходимы ещё два этапа - отбор животных-продуцентов и гипериммунизация животных.

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных белковых фракций, преимущественно гамма-глобулинов, и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител.

Выделенные фракции растворяют в меньшем объёме растворителя, по сравнению с исходным объёмом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить животному в меньших дозах.

В производственных условиях очистку и концентрацию сывороток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим следующие стадии:

- ферментативный гидролиз;

- прогрев ферментативных сывороток в кислой среде;

- солевое фракционирование;

- дополнительная очистка от неактивных белков;

- использование органических растворителей, сорбентов;

- дополнительное выдерживание сывороток при пониженных температурах.

При такой обработке удаляется до 80-85 % балластных белков сыворотки (Тутов И. К. 1997 г).

Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. Производственные опыты по ультрафильтрации сывороток дали возможность сконцентрировать их в три раза и практически без потерь иммуноглобулинового компонента.

Получение гамма-глобулина риваноловым методом

В условиях хозяйства

В условиях хозяйства можно легко и просто получить гамма-глобулин риваноловым методом и использовать его для профилактики болезней молодняка и лечения больных животных.

Например. Берут кровь от клинически здоровых коров хорошей упитанности (вакцинированных против различных инфекционных болезней; животных-реконвалесцентов, не являющихся микробоносителями; за 2 месяца до отела или через 2 недели после отела).

От одной коровы можно брать до 3 литров крови из яремной вены.

Кровь отстаивают при комнатной температуре до полного свертывания и отделяют сыворотку. К 100 мл сыворотки крови добавляют 30 мл 3 %-ного раствора риванола (этакридин лактат). Сыворотка мутнеет, в результате выпадения в осадок альбуминов, альфа- и бета-глобулинов, которые связываются с риванолом. Смесь сыворотки и риванола отстаивают в течение 30 минут в условиях холодильника (4° С). Затем в полученный раствор добавляют поваренную соль (NaCl) из расчета 0,5-0,8 % к объему раствора (0,65-1,04 г на 130 мл объема сыворотки с риванолом) для дополнительного осаждения балластных белков и уплотнения осадка. Смесь сыворотки, риванола и соли отстаивают в течение 1 часа при комнатной температуре и фильтруют через бумажные обеззоленные фильтры. На фильтре остаются альбумины, альфа- и бета-глобулины, а также риванол, в фильтрате - гамма-глобулин.

Раствор гамма-глобулина должен быть прозрачным, желтоватого или розоватого цвета. Препарат фасуют в стерильные стеклянные флаконы и закрывают резиновыми пробками. Флаконы и пробки стерилизуют кипячением в течение 1 часа.

Затем проводят контроль качества готового препарата.

В условиях хозяйства можно провести контроль на стерильность и безвредность полученного гамма-глобулина.

Для определения стерильности укупоренный флакон гамма-глобулина помещают в теплое место (возле батареи или калорифера) на 3 суток. Стерильный раствор гамма-глобулина через 3 суток останется прозрачным. Если раствор помутнел, значит в нем размножаются микроорганизмы. Всю полученную партию гамма-глобулина бракуют.

Для определения безвредности полученного гамма-глобулина, его вводят здоровому теленку в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы подкожно или внутримышечно. Если препарат безвреден, то изменений в общем состоянии животного не наблюдается.

Полученный гамма-глобулин применяют подкожно, для профилактики желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка животных в дозе 0,5 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 2 дня подряд, с терапевтической целью – в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 3 дня подряд. Первую инъекцию гамма-глобулина животному вводят дробно: вначале 1:10 дозы, через 15 минут (если не отмечаются отклонения в общем состоянии животного) вводят оставшееся количество препарата. Гамма-глобулин, полученный риваноловым методом, можно также давать животным внутрь.

Гамма-глобулин должен храниться при t = 4⁰ С, в темном месте. Срок годности 0,5-1,0 год с момента изготовления препарата.