Осаждение гамма-глобулина сернокислым аммонием

Сернокислый аммоний предварительно в течение 1-2 дней высушивают в термостате при температуре + 37, +38⁰С, для чего его помещают в тазики слоем в 3-5 см толщиной. Максимальное осаждение гамма-глобулина из сыворотки наступает при насыщении ее данной солью до 30-33 %.

Для достижения такой концентрации соли в сыворотке осаждение проводят 2,78–молярным раствором соли. Для его приготовления берут 367,2 г высушенного сернокислого аммония (с молекулярным весом 32,076), высыпают его в однометровую мерную колбу и добавляют стерильную дистиллированную воду до 1 л. Раствор подогревают до 80-90⁰С и в горячем виде фильтруют в стерильную посуду через двойной складчатый бумажный фильтр. После охлаждения раствор подкисляют децинормальным раствором серной кислоты до рН 5,5-5,7.

Приготовленный раствор можно использовать в течение 1 месяца, но лучше употреблять свежеприготовленный.

Для осаждения гамма-глобулина исходную сыворотку разводят половинным объемом стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора. После чего, к разведенной сыворотке добавляют равный объем 2,78–молярного раствора сернокислого аммония, имеющего рН 5,5-5,7. Полученная смесь раствора и сыворотки должна иметь рН 7,0-7,2. Раствор соли следует добавлять небольшими порциями при постоянном помешивании.

После прибавления раствора соли наступает резкое помутнение сыворотки, в результате выпадения в осадок гамма-глобулиновой фракции.

Сосуд со смесью сыворотки и раствора сернокислого аммония выдерживают 20-60 минут при t = +4 - +2⁰С, затем центрифугируют 30 минут при 1500-3000 об/мин.

Полученный плотный осадок белого или розового цвета представляет собой в основном гамма-глобулины. Надосадочная жидкость содержит альфа-, бета-глобулины и альбумины.

Осадок гамма глобулина растворяют в физиологическом растворе в объёме, равном 1/10 взятого для фракционирования первоначального объёма сыворотки.

Изготовленный гамма-глобулин содержит сернокислый аммоний и некоторое количество серной кислоты, от которых нужно избавляться. Для удаления последних, гамма-глобулин сливают в целлофановый мешок и ставят на диализ против физиологического раствора. Диализ ведут при t = +2 - +4⁰С. При диализе верхний уровень физиоло-гического раствора в сосуде должен быть значительно ниже верхнего уровня гамма-глобулина в целлофановом мешке.

Каждый день в сосуде для диализа 3 раза сменяют физиологический раствор. Слитый физиологический раствор проверяют на наличие в нём сернокислого аммония путём добавления к нему небольших количеств 10 % раствора хлористого бария. При наличии аммония образуется помутнение.

Диализ ведут до тех пор, пока не будет отрицательной реакция на хлористый барий. Обычно диализ заканчивается через 3-4 дня. Во время диализа объём жидкого гамма-глобулина несколько увеличивается.

После диализа определяют процентное содержание белка и рН жидкого гамма-глобулина. Если рН меньше 7,0, то к нему прибавляют 10 % раствор безводного углекислого натрия, до рН 7,2-7,4; фильтруют через пластинки СФ фильтра Зейтца, расфасовывают во флаконы, наклеивают этикетки, хранят при t = +2 +4⁰ С. Поскольку некоторые серии гамма-глобулина являются нестойкими, то лучше не подвергать их длительному хранению, а использовать свежеприготовленными или подвергать высушиванию.

Для осаждения гамма-глобулина можно также пользоваться 2,78-молярным раствором сернокислого аммония без подкисления, с рН 7,0-7,4.

В обоих случаях осаждения гамма-глобулина сернокислым аммонием, полученный препарат содержит примеси бета- и альфа- глобулиновых фракций, иногда в больших количествах. Для получения более очищенного гамма-глобулина без примесей других белков проводят 2-3 разовое переосаждение.

В этом случае осадок гамма-глобулина, полученный при первом осаждении, растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе, paвнoм половинному (или 30 %-ному) объёму исходной сыворотки. После растворения гамма-глобулина, к нему добавляют 2,78-молярный раствор сернокислого аммония, в объёме, равном объёму прибавленной дистиллированной воды. Смесь выдерживают 30 минут при t = +2 - +4⁰C, затем центрифугируют 30 минут при 1500- 3000 об/мин.

Третье осаждение проводят также – как второе. Гамма-глобулин после третьего осаждения растворяют в физиологическом растворе, взятом в объёме, равном 1/10 исходного объёма сыворотки.