Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...
История развития хранилищ для нефти: Первые склады нефти появились в XVII веке. Они представляли собой землянные ямы-амбара глубиной 4…5 м...
Топ:
Теоретическая значимость работы: Описание теоретической значимости (ценности) результатов исследования должно присутствовать во введении...
Эволюция кровеносной системы позвоночных животных: Биологическая эволюция – необратимый процесс исторического развития живой природы...
Проблема типологии научных революций: Глобальные научные революции и типы научной рациональности...
Интересное:
Аура как энергетическое поле: многослойную ауру человека можно представить себе подобным...
Мероприятия для защиты от морозного пучения грунтов: Инженерная защита от морозного (криогенного) пучения грунтов необходима для легких малоэтажных зданий и других сооружений...
Искусственное повышение поверхности территории: Варианты искусственного повышения поверхности территории необходимо выбирать на основе анализа следующих характеристик защищаемой территории...
Дисциплины:
2017-06-26 | 88 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Для предварительной обработки и остановки метафазы смотри таблицу 1. После обработки, корни, побеги или пыльники с клетками материнской пыльцы (PMC) зафиксированы в 3:1 (этанол:уксусная кислота) на 30-50 минут при комнатной температуре. Клеточная суспензия была приготовлена strait away(не знаю как это) или источники клеток были накоплены ночью в морозилке при -20°С прошедшие обработку ферментами.
Таблица 1
Условия остановки метафазы и обработки ферментами
Виды | Реагенты и требования | Концентрация ферментов | Время выдержки в ферменте |
Allium cepa, Allium fistulosum, Allium schoenoprasum, Allium altaicum | 0.75 mM hydroxyurea for 20 h (RT), 0.05% colchicine for 3.5-4 h (RT) | 0.6% | 90–100 min |
Humulus japonicus, Humulus lupulus, Linum usitatissimum, Cannabis sativa, Ricinus communis | 2 mM 8-hydroxyquinoline, 4 h | 0.6% | 100–120 min |
Triticale, Triticum aestivum, Thinopyrum ponticum, Thinopyrum elongatum | 0.2% colchicine, 2 h1 | 1.2% | 100–120 min |
Brassica nigra, Brassica oleracea, | 1-bromnaphtalene (1:1000 water solution) overnight 4°C | 0.6% | 90–100 min |
Aloe vera, | 1.2% | 100–120 min | |
Rosa wichurana | 0.3% | 90–120 min | |
Anthurium andreanum, Monstera deliciosa, Philodendron scandens, Spathiphyllum wallisii, Syngonium auritum, Zantedeschia elliotiana, Hippophae rhamnoides, Festuca arundinacea and Lolium perenne | 0.1% | 60–90 min | |
Rosa wichurana 2 | Mix of 0.1% colchicine and 2 mM 8-hydroxyquinoline (4 h, RT)3 | 1.2% | 120–150 min |
Allium wakegi, Allium roylei | Nitrous oxide gas (1.0 MPa), 3 h | 0.6% | 90–100 min |
Allium cepa PMC | - | 1.5% | 180–200 min |
1the same treatment was used for shoot meristems of Triticale and Triticum aestivum.
2applied to shoot meristems.
3this procedure was carried out according to Ma et al., 1996 [30].
Запас смеси фермента, содержащего (w/v) 6% Пектолиаза Y-23 (Kikkoman, Tokyo, Japan), 6 % Целюлаза Onozuka R-10 (Yakult Co. Ltd., Tokyo, Japan) и 6% Цитогеликаза (Sigma-Aldish Co.LLC, France), приготовлены в 0.1 М цитрусовый буфер (citric buffer) (pH4.8). Концентрация действующей смеси фермента и время содержания в них для разных видов приведены в таблице1.
Протокол препарирования хромосом, использующий метод “SteamDrop”.
Обработка ферментами
|
1. Промыть корни (пыльников или побегов) в воде в течение 10-30 мин
2. Расчленить меристемы и перенести их в 0.1М цитрусовый буфер (citric buffer), pH 4.8
3. Перенести 1-5 меристем в 0.5 мл пробирки с 20-30 μl смеси фермента (Таблица 1)
4. Содержать в 37 °С для 1-2.5 часов, в зависимости от вида (Таблица 1)
Приготовление клеточной суспензии
1. Воронка/вода/прокрутить в водовороте (Vortex) пробирки с обработанной меристемой для получения суспензии
2. Добавить 600 μl дистиллированной воды и смешать
3. Подвергнуть центрифуге на 10,000 rpm на 45 секунд
4. Удалить надосадочную жидкость используя пипетку Пастера
5. Добавить 600 μl 96% этанола и смешать (клеточная суспензия может хранится при -20°С по крайней мере 6 месяцев)
6. Подвергнуть центрифуге на 11,000 rpm на 30 секунд
7. Удалить надосадочную жидкость перевернув пробирку
8. Ресуспензировать (перерастворить, гомогенизировать) гранулу (pellet) в 20-100 μl 96% этанола, в зависимости от концентрации клеток.
Препарирование хромосом
1. Капнуть 10 μl клеточной суспензии на предметное стекло* и ждать, пока поверхнасть не станет гранулированной (зернистой), т.е. мениск этанола прошёл в центр клеток, (10-15 секунд) (мениск- искривление жидкости вследствие соприкосновения с поверхностью)
2. Капнуть 18-22 μl фиксатора (1:1, 2:1, 3:1 или 5:1 этанол:уксусная кислота)** и ждать пока поверхность не станет зернистой и слой фиксатора не утоньчится (25-35 секунд)
3. Положить стёкла вверх ногами под пар от водяной бани на 55°С (10-15 см от поверхности воды водяной бани) на 3-5 секунд
4. Для удвоения “SeteamDrop”, повторить шаг 2 но с меньшим объёмом (3-6 μl) фиксатора и повышенной концентрацией уксосной кислоты. Выполнить шаг 3 только в течение 1 секунды.
5. Немедленно высушить стёкла сухим воздухом (таким как от настольного вентилятора).
Пометки
* - для препарирования крупных хромосом используется поверхность стёклышка с APES (3-аминопропил-триэтокси-силан) для предотвращения частичной отслойки хромосом. APES покрывает стёклышки: 1.5% APES в 100% ацетоне на 30 секунд, дважды промыть в дистиллированной воде и сушить 1 час на 37°С.
|
** - Протокол позволяет легко скорректировать результаты обработки ферментами – проверяется уровень ферментативной обработки ткани в первом препарате хромосом под микроскопом, если ткань при обработке стала сильно переваренная– использовала высокую пропорцию уксусной кислоты в фиксаторе (1:1 или 2:1); если обработанная ткань менее “переваренная” – маленькая пропорция уксусной кислоты в фиксаторе (5:1 Или 10:1). (речь о степени обработанности, скорее всего это видно невооружённым глазом под микроскопом).
Подготовка проб Probe preparation
LFS and bulb alliinase gene fragment (не знаю что это, связанно с генами лука)
The LFS and bulb alliinase gene пробы фрагментов были получены с использованием специфических праймеров (для LFS: LFSbeF: 5′-AAATGGAGCTAAATCCTGGTG-3′, LFSbeR: 5′-CATAATGCATCACAGCACTGAA-3′; для alliinase: Allbe1F: 5′-GGTCATCTCCCTTTCACCAA-3′, Allbe1R: 5′-TGATCAAACTCAAACGCAC-3′) разработано программным обеспечением Primer 3.0 (http://bioinfo.ebc.ee/primer3-0.4.0/) используя LFS [GenBank: AB094593.1] и alliinase [GenBank: L48614] последовательности из GenBank в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). ПЦР условия были 94°С – 1 минута, 35 циклов; 94°С – 1 минута; 58°С – 1 минута; 72°C – 1 минута; окончательное растяжение (final elongation): 72°С – 3 минуты. Продукты ПЦР были клонированы с помощью pPCR-TOPO инструмеетов (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) согласно описанию производителя (какой-то стандарт). Плазмидная ДНК была выделена из белых колоний, секвенированна и секвенировалась с помощью BLASTN (программа для секвенирования). Плазмиды высокой схожестью с LFS или с bulb alliinase генетическими фрагментами были отобраны для маркировки с Biotin Nick Translation Mix (смесь Биотина Ника транслятора) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).
S rDNA
Плазмиды несущие 5S rRNA ген ржи (pScT7, [31] промаркирован с помощью Biotin-16-dUTP с Biotin- Nick Translation Mix согласно описанию производителя (какой-то стандарт) (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany).
(AAC)5 олигонуклеотид
(AAC)5 олигонуклеотид промаркерован биотином в 3’- и 5’ –концах синтезированных в ZAO ‘Syntol’ (Moscow, Russia).
Выделение ДНК
Геномная ДНК была выделена согласно Роджерса и Bendich. ()
Tyramide-FISH
Пробы гибридизации и обнаружение сигнала было сделано согласно Khrustaleva и Kik с незначительными изменениями. После RNAse обработки и шага денатурации, предметные стекла были зафиксированы в 4% параформальдегидном буфере в 1 × PBS (10 × PBS: 1.3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4, pH 7.5) на 8 минут и 10 минут, соответственно. Шаг инактивации эндогенной пероксидазы был проведён выставлением предметных стекол в 0.01М HCl на 8 минут. Смесь гибридизайии (hybridization mixture) состояла из 50% (v/v) деионизированном формамиде, 10% (w/v) декстран сульфате, 2 х SSC, 0.25% додецилсульфате натрия, 2.75 ± 1.00 ng/μl проб ДНК. Смесь подверглась денатурации на 75°С на 5 минут и впоследствии размещена на лёд на 5 минут. 60 микролитров (microliters) смеси были добавлены к препаратам хромосом, покрыв их плёнкой (22 × 32 mm) и денатурировалось всё 5 минут на 80°С. 82% строгого промывания было применено: стёкла были промыты в 2 х SSC дважды по 5 минут на 37°С, в 25% (v/v) формамиде в 0.4. х SSC дважды по 10 минут на 42°С, В то время как в 2 х SSC на 3 минуты при 37°С. Обнаружение растворения тирамида было приготовлено тчательным перемешиванием в 1:50 маточного раствора Тирамида в сильном растворителе (Perkin Elmer, Inc., Waltham, Massachusetts, USA) с 10ю% (w/v) декстран сульфате (dextran sulfate.)
|
FISH
Процедура FISH с 5S rDNA и биотинилированным (ААС)5 в качестве пробы была проведена согласно протоколу Хеслопа-Харисона и др. и Счмидта и др. с небольшим изменением приготовления предметных стекол (или препаратов slide preatreatment) до добавления смеси гибридизации (hybridization mix.) Дополнительная обработка с 4% буферным раствором параформальдегида (BPS), pH 8.0, на 9 минут до обработки RNA с использованием пепсина и пепсин исключался.
Микроскопирование и исследование изображения
Предметные стёкла были изучены под микроскопом Zeiss Axio (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Отобранные изображения были сфотографированы с помощью Axio Cam MRm камеры. Обработка изображений производилась с помощью программного обеспечения AxioVision ver.4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). Итоговая картинка оптимизировалась в фотошопе (Adobe Inc., San Jose, California, USA).
Результаты
|
|
Индивидуальные и групповые автопоилки: для животных. Схемы и конструкции...
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...
Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
Индивидуальные очистные сооружения: К классу индивидуальных очистных сооружений относят сооружения, пропускная способность которых...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!