Определение первичной структуры кДНК промоторного участка гена FAS в клетках опухолевых очагов больных раком толстого кишечника

С целью выявления аллельных вариантов однонуклеотидного полиморфизма Fas-670A/G) в промоторной области гена FAS была определена первичная структура 4 образцов нуклеотидных последовательностей промоторных областей гена FAS, выделенных из клеток опухолевого очага больных раком толстого кишечника.

Первичные последовательности хромосомных ДНК промоторных участков генов Fas сравнивали между собой и с последовательностями хромосомных ДНК промоторных участков данных генов, полученными в международной базе данных EMBL Gene Bank. В результате сравнения было обнаружено, что в 4 образцах выявлялись гомозиготные варианты аллеля по А (1 образец) и G (1 образец) и 2 гетерозиготы AG (2 образца) (рис.4).

 

 

Рис. 4. Первичная структура ДНК промоторной области гена Fas, выделенной из образца клеток опухолевого очага больного раком толстого кишечника.

Разработка метода аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G

Промоторного участка гена Fas

Поскольку метод прямого определения нуклеотидной последовательности промоторных участков сопряжен с большой сложностью, затратами времени и реактивов, нами был разработан более удобный метод аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas.

Для этого нами была подобрана комбинация специфических праймеров (двух прямых и одного обратного). Каждый из прямых праймеров был специфичен либо к аллельному варианту Fas-670A, либо к Fas-670G.

Из клеток периферической крови здоровых доноров была выделена тотальная ДНК. Полученная кДНК Fas амплифицировалась с помощью ПЦР со специфическими праймерами. Результаты амплификации визуализировались с помощью электрофореза в агарозном геле.

На первом этапе работы при ПЦР была задана температура отжига праймеров 55ºС. (условия ПЦР см. в таблице 4). В результате было получено много неспецифических продуктов амплификации (рис.5).

 

 

A G

Рис.5. Электрофореграмма детекции альтернативных аллелей гена Fas (подбор условий реакции при температуре отжига праймеров 55°С).

На втором этапе работы оптимизировались условия амплификации промоторных участков гена FAS. Была использована модификация метода ПЦР Hot Start, при которой амплификация неспецифических продуктов исключалась добавлением Taq-полимеразы в нагретую до 80°С реакционную смесь. Температура отжига праймеров варьировалась от 60ºС до 65ºС и увеличено количество циклов ПЦР до 45. (рис.6). В результате были получены специфические продукты амплификации промоторного участка гена FAS, содержащие аллельные варианты однонуклетидного полиморфизма Fas-670A\G. Наиболее оптимальными условиями ПЦР оказались при температуре отжига праймеров 62ºС и количестве циклов 45.

60°С 62° С 63°С

A G A G A G

Fas snp

Рис.6. Электрофореграмма оптимизации условий ПЦР для детекции аллелей гена Fas.

Выводы

 

- Выявлены аллельные варианты промоторной области гена APT-1 (однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G) в клетках опухолевого очага больных раком толстого кишечника методом прямого определения нуклеотидной последовательности.

- При разработке метода аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas подобран оптимальный температурный режим (62ºС), количество циклов ПЦР (45) и специфические праймеры.

Список литературы

1. Новиков В.В., Добротина Н.А., Бабаев А.А. Иммунология. Н. Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2005. 239 с.

2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени» М.: БИНОМ, 2009. 223 с.

3. Broen J., Gourh P., Rueda B. et al. The FAS -670A>G polymorphism influences susceptibility to systemic sclerosis phenotypes // Arthritis. Rheum. 2009. Vol.60. Р.3815-3820.

4. Cao Y., Miao X.P., Huang M.Y. et al. Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL and risk of nasopharyngeal carcinoma // Mol. Carcinog. 2010.Vol.49. P.944-950.

5. Cheng J., Liu C., Koopman W.J. et al. Characterization of human Fas gene. exon/intron organization and promoter region // J. Immunol. 1995. Vol.154. Р.1239-1245.

6. Colella S., Yau C., Taylor J.M. et al. Making SNPs make sense // Pharmacogenetics. 2011. Vol. 12. P.1-2.

7. De Maria R., Boirivant M., Cifone M.G. et al. Functional expression of Fas and Fas ligand on human gut lamina propria T lymphocytes. A potential role for the acidic sphingomyelinase pathway in normal immunoregulation // J. Clin. Invest.1996. Vol. 97. P.316-322.

8. Engelmark M. T., Renkema K. Y., Gyllensten U. B.. No Evidence of the Involvement of the Fas-670 Promoter Polymorphism in Cervical Cancer In Situ // Int. J. Cancer. 2004. Vol.112. P.1084–1085.

9. Geleijnsab Karin, Lamanb Jon D., Rijsab Wouter van et al. Fas polymorphisms are associated with the presence of anti-ganglioside antibodies in Guillain–Barré syndrome (GBS) // Journal Home. 2005. Vol.161. P.183-189.

10. Hampe J., Shaw S.H., Saiz R. et al. Linkage of inflammatory bowel disease to human chromosome 6p. // Am. J. Hum. Genet.1999. Vol.65. P.1647-1655.

11. Hanasaki Hiroko, Takemura Yukihiro, Fukuo Keisuke et al. Fas promoter region gene polymorphism is associated with an increased risk for myocardial infarctionFas gene polymorphism in cardiovascular disease // Hypertension Research. 2009. Vol.32. Р.261-264.

12. Hofmann Guenter, Langsenlehner Uwe, Langsenlehner Tanja. A common hereditary single nucleotide polymorphism in the gene of FAS and colorectal cancer survival // Journal of Cellular and Molecular Medicine.2009. Vol.10. P.1-12.

13. Huang Q.R., Morris D., Manolios N. Identification and characterization of polymorphisms in the promoter region of the human Apo-1/Fas (CD95) gene // Mol. Immunol. 1997. Vol.34. P.577-582.

14. Jrad B. B. H, Wijden M., Noureddine B. et al. A polymorphism in FAS gene promoter associated with increased risk of nasopharyngeal carcinoma and correlated with anti-nuclear autoantibodies induction // Cancer Letters. 2006. Vol.233. P. 21-27.

15. Jung Yong Jin, Kim Yoon Jun, Kim Lyoung Hyo et al. Putative Association of Fas and FasL Gene Polymorphisms with Clinical Outcomes of Hepatitis B Virus Infection // Intervirology. 2007. Vol. 50. Р. 369–376.

16. Kanemitsu S., Ihara K., Saifddin A. et al. A functional polymorphism in Fas (CD95/APO-1) gene promoter associated with systemic lupus erythematosus // J. Rheumatol. 2002. Vol.29. P.1183–1188.

17. Kang Sung Wook, Chung Joo-Ho, Kim Dong Hwan et al. A Promoter SNP (rs1800682, -670C/T) of FAS Is Associated with Stroke in a Korean Population // Genomics & Informatics. Vol. 8, №4. P.206-211.

18. Kelly J. A., Pociot F., Moser K. L. et al. Functional promoter haplotypes of the human FAS gene are associated with the phenotype of SLE characterized by thrombocytopenia // Genes and Immunity. 2005. Vol. 6. P.699–706.

19. Kim K.M., Lee K., Hong Y.S., Park H.Y. Fas-mediated apoptosis and expression of related genes in human malignant hematopoietic cells // Exp. Mol. Med. 2000. Vol.32. Р.246-254.

20. Kruglyak L., Nickerson,D.A. Variation is the spice of life. Nat. Genet. 2001. Vol.27. P. 234–236.

21. LaFramboise Th. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances // Nucleic Acids Research. 2009. Vol. 37, № 13. P. 4181–4193.

22. Lee Y.H., Ji J.D., Sohn J., Song G.G. Polymorphsims of CTLA-4 exon 1 +49, CTLA-4 promoter -318 and Fas promoter -670 in spondyloarthropathies // Clin. Rheumatol. 2001. Vol.20. P.420-422.

23. Leithauser F., Dhein J., Mechtersheimer G. et al. Constitutive and induced expression of Apo-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells // Lab. Invest. 1993. Vol.69. Р.415-429.

24. Lerma E., Romero M., Gallardo A. et al. Prognostic significance of the Fas-receptor/Fas-ligand system in cervical squamous cell carcinoma // Medicine. 2011.Vol. 452, №1. P.65-74.

25. Liakouli V., Manetti M., Pacini A. et al. The −670G>A polymorphism in the FAS gene promoter region influences the susceptibility to systemic sclerosis // Ann. Rheum. Dis. 2009. Vol.68. P.584-590.

26. Nagata S. Apoptosis regulated by a death factor and its receptor: Fas ligand and Fas // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1994. Vol.354. Р.281-287.

27. Nagata S. Fas ligand-induced apoptosis // Annu. Rev. Genet.1999. Vol.33. P.29-55.

28. Niino M., Kikuchi S., Fukazawa T. et al. An examination of the Apo-1/Fas promoter Mva I polymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis // BMC Neurology. 2002. Vol.2. P.8.

29. Perkin Elmer. SNP and Genotyping Overview // Pharmacogenomics. 2005. Vol. 12. Р.1.

30. Rudert F., Visser E., Forbes L. et al. Identification of a silencer, enhancer, and basal promoter region in the human CD95 (Fas/Apo-1) gene // DNA Cell. Biol. 1995. Vol.14. Р.931-937.

31. Sibley K., Rollinson S., Allan J.M. et al. Functional FAS promoter polymorphisms are associated with increased risk of acute myeloid leukemia // Cancer Res. 2003. Vol.63. P.4327-4330.

32. Smith Kaleigh. Genetic Polymorphism and SNPs // Functional Genomics and Proteomics. 2002. Vol.14. Р.21.

33. Sun T., Zhou Y., Li H. et al. FASL –844C polymorphism is associated with increased activation-induced T cell death and risk of cervical cancer // J. of Experimental Medicine. Vol. 202, №7. P.967-974.

34. Ueda M., Terai Y., Hung Y.C. Fas gene promoter -670 polymorphism (A/G) is associated with cervical carcinogenesis // Gynecol. Oncol. 2005. Vol.98, №1. P.129-133.

35. Urquhart J. SNPs on display // Nano Letters. 2011. Vol.10. Р.1021.

36. Wang Meilin, Wu Dongmei, Tan Ming et al. FAS and FAS Ligand Polymorphisms in the Promoter Regions and Risk of Gastric Cancer in Southern China // Biochem. Genet. 2009. Vol.47. P.559–568.

37. Wasfi Y.S., Silveira L.J., Jonth A. et al. Fas promoter polymorphisms: genetic predisposition to sarcoidosis in African-Americans // Tissue Antigens. 2008. Vol.72, №1. P.39-48.

38. Yang Ming, Sun Tong, Wang Li et al. Functional Variants in Cell Death Pathway Genes and Risk of Pancreatic Cancer // Clin. Cancer Res. 2008. Vol.14, №10. P.3230-3236.

39. Zhang Zhizhong, Xue Hengchuan, Gong Weida et al. FAS promoter polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis based on 34 case-control studies // Carcinogenesis. 2009. Vol.30, №3 P.487–493.

40. Zhu Q., Wang T., Ren J. et al. FAS-670A/G polymorphism: A biomarker for the metastasis of nasopharyngeal carcinoma in a Chinese population // Clin. Chim. Acta.2010. Vol.411. P.179-183.