Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...
Своеобразие русской архитектуры: Основной материал – дерево – быстрота постройки, но недолговечность и необходимость деления...
Топ:
Оснащения врачебно-сестринской бригады.
Определение места расположения распределительного центра: Фирма реализует продукцию на рынках сбыта и имеет постоянных поставщиков в разных регионах. Увеличение объема продаж...
Интересное:
Аура как энергетическое поле: многослойную ауру человека можно представить себе подобным...
Принципы управления денежными потоками: одним из методов контроля за состоянием денежной наличности является...
Национальное богатство страны и его составляющие: для оценки элементов национального богатства используются...
Дисциплины:
2017-06-20 | 218 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Для проведения ПЦР готовили необходимое количество реакционной смеси для анализа необходимого числа проб в пропорциях, представленных в таблице 2. Для устранения погрешности, вносимой дозаторами при смешивании микрообъемов, общую смесь готовили из расчета на одну пробу больше, чем необходимо.
Таблица 2
Состав реакционной смеси для проведения ПЦР
Количество проб | |||||
10XБуфер (мкл) | 2,5 | 7,5 | 12,5 | ||
dNTP(мкл) | |||||
F-праймер (GR-20)(мкл) | 0,5 | 1,5 | 2,5 | ||
Tag-pol(мкл) | 0,5 | 1,5 | 2,5 | ||
2d H2O(мкл) | |||||
R-праймер (Fas-OF) (мкл) | 0,5 | 1,5 | 2,5 |
Смесь хорошо перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин.
В маркированные пробирки объемом 0.5 мл вносили по 23 мкл полученной реакционной смеси и по 2 мкл ДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Компоненты перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), смесь кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Для предотвращения испарения жидкости реакционную смесь покрывали двумя каплями минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе Fas Hot Start.
Таблица 3
Условия инкубации реакционной смеси в амплификаторе «Терцик»
Температура в 1 цикле | Длительность цикла, сек. | Общее количество циклов |
94ºС | ||
94 ºС | ||
65ºС | ||
72ºС | ||
72ºС |
Таблица 4
Праймеры для выявления полиморфизма Fas -670 (A/G)
Праймеры | Нуклеотидная последовательность (5´-3´) |
Fas snp F (A) | 5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgA-3' |
Fas snp F(G) alt | 5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgg -3' |
Fas snp R | 5'-TggCATgCTCACTTCAggTg -3' |
|
Таблица 5
Первичная структура праймеров для амплификации промоторного
участка гена FAS, содержащего олигонуклетидный полиморфизм Fas-670A\G
Праймер | Нуклеотидная последовательность 5’- 3’ |
FasFp | AgTgTgTCCAgTCTggAACT |
FasRp | CgAggTAACTAAgTCgTTgA |
Результаты реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле.
2.5 Визуализация результатов ПЦР методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1,5% агарозном геле (Maniatis, 1982)
Готовили 1,5%-ный агарозный гель с лунками для внесения проб. Для этого 1,5 г агарозы разводили в 100 мл рабочего трис-ацетатного буферного раствора (24,2 г трис-(гидрокси)аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М раствора этилендиаминотетрауксусной кислоты, pH 8.0) и добавляли 10мкл 10%-ного водного раствора бромида этидия. Суспензию нагревали на водяной бане до полного растворения агарозы, периодически помешивая. Раствору давали остыть примерно до 50˚С и заливали в форму для агарозного блока, вставляли гребенку для образования лунок и давали агарозе застыть до состояния геля.
Из-под слоя масла отбирали 10 мкл раствора амплифицированной ДНК и смешивали с 10 мкл буферного раствора для нанесения проб (50% глицерина, 0,25% бромфенолового синего в дистиллированной воде). Полученную смесь переносили в лунки геля. Камеру для электрофореза «Helicon» (г. Москва) подключали к источнику питания «Эльф-2» (Россия), соблюдая полярность. Проводили электрофорез в течение 15 минут при напряжении 200 вольт (краситель должен пройти не менее 2 см геля). Отключали ток. Помещали гель в окно трансиллюминатора «Biokom UVT-1» (Франция). Результат регистрировали с использованием системы видеодокументирования «VITRan».
Прямое определение нуклеотидной последовательности
Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля с последующей элюцией и очищали с использованием набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Латвия) согласно рекомендациям производителя. Реакцию терминирования дидезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными флюоресцентными красителями, проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). К 5 мкл ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94°С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94°С – 10 сек, 50°С – 10 сек, 62° – 4 мин. Реакционную смесь переосаждали изопропанолом, разводили в 20 мкл деионизованного формамида и прогревали при 94°С в течение 5 мин. Затем проводили анализ нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК с использованием генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).
|
Результаты и их обсуждение
|
|
Индивидуальные очистные сооружения: К классу индивидуальных очистных сооружений относят сооружения, пропускная способность которых...
Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...
Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!