Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰)...
Топ:
Устройство и оснащение процедурного кабинета: Решающая роль в обеспечении правильного лечения пациентов отводится процедурной медсестре...
Техника безопасности при работе на пароконвектомате: К обслуживанию пароконвектомата допускаются лица, прошедшие технический минимум по эксплуатации оборудования...
История развития методов оптимизации: теорема Куна-Таккера, метод Лагранжа, роль выпуклости в оптимизации...
Интересное:
Распространение рака на другие отдаленные от желудка органы: Характерных симптомов рака желудка не существует. Выраженные симптомы появляются, когда опухоль...
Отражение на счетах бухгалтерского учета процесса приобретения: Процесс заготовления представляет систему экономических событий, включающих приобретение организацией у поставщиков сырья...
Искусственное повышение поверхности территории: Варианты искусственного повышения поверхности территории необходимо выбирать на основе анализа следующих характеристик защищаемой территории...
Дисциплины:
2017-06-11 | 1609 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Установка для электрофореза в агарозном геле. На рисунке 7 представлены основные элементы для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. Схематично, установку можно представить как емкость для электродного буфера, по краям которой расположены два электрода. В пространство между электродами заливается проводящий буфер, в котором проводится электрофорез, и помещают гель. При этом гель может быть залит непосредственно в камере, а может быть залит отдельно на специальном лотке, который помещается в камеру.
Агароза. Природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом, образованным повторяющимся элементом ‒ агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов: галактозы и 3,6-ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка, и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются преимущественно для разделения больших молекул.
Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс, плотность которого определяется концентрацией.
Буфер для электрофореза. На электрофоретическую подвижность ДНК воздействуют состав и ионная сила буфера для электрофореза. В отсутствии ионов, электропроводность минимальна, и перемещение ДНК происходит медленно. В буфере с высокой ионной силой электропроводность очень эффективна, и образуется значительное количество тепла. В худшем случае, гель расплавляется и ДНК денатурирует. Существует несколько буферов для электрофореза нативной двухцепочечной ДНК. Они содержат ЕОТА (рН 8,0) и Тгis-ацетат (ТАЕ), Тгis-борат (ТВЕ), или Тгis-фосфат (ТРЕ).
|
Маркерная ДНК. При заданном напряжении, концентрации агарозного геля и буфера, расстояние перемещения зависит от молекулярного веса исходного материала. Поэтому, маркерная ДНК известного размера должна наноситься на дорожки и с левого, и с правого края геля. Маркер обычно содержит определенный набор известных сегментов ДНК, которые облегчают определение размера исследуемой ДНК, если какое-либо систематическое искривление геля возникнет во время электрофореза.
Буфер для нанесения. Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие).
Окраска и фиксация
Для анализа результатов электрофореза, после его завершения, требуется, прежде всего, визуализовать картину распределения полос в геле. С этой целью могут применяться два основных подхода. Первый способ состоит в окрашивании ДНК специфическими красителями. Для этой цели существует большое разнообразие красителей, способных специфически окрашивать двунитевые или однонитевые участки ДНК, ДНК в составе различных комплексов или в определённой конформации. К достоинствам такого подхода можно отнести высокую чувствительность, избирательность окрашивания и дешевизну метода. Среди недостатков можно упомянуть относительную трудоёмкость процедуры, невозможность следить за ходом электрофореза в реальном времени, токсичность некоторых из широко применяемых красителей, воздействие красителей на структуру ДНК, и необходимую иногда предварительную фиксацию ДНК в геле.
Другой путь основан на способности самой ДНК поглощать свет в УФ диапазоне. Поэтому можно просканировать гель в УФ-свете и определить местоположение ДНК в геле. В настоящее время промышленностью выпускаются специальные комплексы, позволяющие следить за миграцией ДНК в геле в автоматическом режиме непосредственно в ходе электрофореза и получать оцифрованное изображение в любой момент времени. При использовании этого подхода предварительная фиксация ДНК в геле не требуется. К недостаткам подхода можно отнести малую избирательность метода и относительную дороговизну оборудования.
|
Наиболее распространенным красителем ДНК в экспериментах по электрофорезу является бромистый этидий. Этот краситель относится к соединениям, способным интеркалировать между парами оснований ДНК. Вещество является сильным канцерогеном и мутагеном, способным проникать через кожу. По этой причине работа с ним требует особой осторожности и соблюдения повышенных мер безопасности. При работе с бромистым этидием всегда необходимо использовать перчатки и маску. Отходы, содержащие бромистый этидий, требуют специальной утилизации.
ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ
1. Для приготовления 1%-го геля ‒ смешайте 100 мл воды и 1 г агарозы и доведите раствор до кипения. Размешайте до ресуспендирования осевшей агарозы. В пластиковую кювету для геля установите гребенку под будущие лунки. Влейте агарозу в кювету. Агароза должна заполнить куветю полностью. Когда гель затвердеет, осторожно удалите гребенку.
2. Готовим камеру ‒ кладем пластиковую кювету с гелем в камеру, заливаем буфером так, чтобы гель скрылся под ним.
3. Вносим 5–10 мкл образца в лунки и закрываем верхней крышкой.
4. К черному штекеру присоединяем отрицательный полюс, а к красному положительный.
5. Включаем форез ‒ 120 В 20–30 мин. Возле электродов должны быть небольшие пузырьки, как индикатор, что форез пошел. ДНК двигается от минуса к плюсу, поэтому лунки с ДНК должны быть возле черного штекера (минуса).
6. Через 20–30 мин, выключаем прибор, открываем крышку и вытаскиваем кувету с гелем шипцапи или используем перчатки. В случае наличия в образце красителя, разделение можно будет увидеть невооруженным глазом, а при его отсутствии просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют.
ОТЧЕТ
Сделать вывод о проделанной работе. Зарисовать электрофореграмму.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Дайте понятие электрофорезу.
2. Дайте понятие электрофорезу в агарозном геле.
3. Физические принципы электрофореза в агарозном геле.
4. Перечислите параметры, от которых зависит движение заряженных частиц в агарозном геле.
5. Перечислите компоненты, необходимые для электрофореза в агарозном геле.
6. Основные элементы установки для электрофореза в агарозном геле.
7. Объясните методы анализа результатов электрофореза, их достоинства и недостатки.
8. К какому полюсу происходит движение молекул ДНК при электрофорезе в агарозном геле и почему?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
|
|
Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни...
Кормораздатчик мобильный электрифицированный: схема и процесс работы устройства...
Эмиссия газов от очистных сооружений канализации: В последние годы внимание мирового сообщества сосредоточено на экологических проблемах...
Таксономические единицы (категории) растений: Каждая система классификации состоит из определённых соподчиненных друг другу...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!