Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...
Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Топ:
Методика измерений сопротивления растеканию тока анодного заземления: Анодный заземлитель (анод) – проводник, погруженный в электролитическую среду (грунт, раствор электролита) и подключенный к положительному...
История развития методов оптимизации: теорема Куна-Таккера, метод Лагранжа, роль выпуклости в оптимизации...
Интересное:
Национальное богатство страны и его составляющие: для оценки элементов национального богатства используются...
Мероприятия для защиты от морозного пучения грунтов: Инженерная защита от морозного (криогенного) пучения грунтов необходима для легких малоэтажных зданий и других сооружений...
Распространение рака на другие отдаленные от желудка органы: Характерных симптомов рака желудка не существует. Выраженные симптомы появляются, когда опухоль...
Дисциплины:
2017-06-09 | 478 |
5.00
из
|
Заказать работу |
Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких, как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов, анализ мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификация личности человека.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последова-тельности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей необходимо короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды.
Механизм полимеразной цепной реакции:
1. Плавление двухцепочечной ДНК: перед началом реакции ДНК-мишень является двухцепочечной, при температуре 94-950С комплементарные цепи ДНК расходятся.
2. Отжиг праймеров: при температуре, оптимальной для выбранных праймеров, происходит их связывание с комплементарным участком ДНК-мишени.
3. Синтез новых цепей ДНК: ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, синтезируя новые цепи ДНК, которые становятся мишенью для праймеров в последующих циклах ПЦР.
4. Количество копий ДНК-мишени растет экспоненциально в последовательных ПЦР.
Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждой из множества повторяющихся циклов.
Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.
В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции.
ПЦР состоит из трех этапов:
1. Денатурация, или «плавление» ДНК, когда двухцепочечная ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние: двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись.
2. Ренатурация (отжиг) праймеров с матричной ДНК: когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.
Время стадии — 0,5—2 мин.
Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления.
3. Элонгация, или удлинения цепи: ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.
Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы.
Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.
Эта стадия длится 7-10 мин.
ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодичес-кое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C.
Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C.
Схема ПЦР
Рис. 27 УФ бокс для выделения ДНК
Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах.
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
Кормораздатчик мобильный электрифицированный: схема и процесс работы устройства...
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой...
Биохимия спиртового брожения: Основу технологии получения пива составляет спиртовое брожение, - при котором сахар превращается...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!