III. Исходный уровень знаний

Тема 2: ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ

I. Мотивация цели

Судебно-химическая экспертиза складывается из предварительного и подтверждающего исследований. Цель предварительного исследования - вы­явить наличие или отсутствие лекарственных средств в органических экстрак­тах с использованием скрининговых методов.

Овладение теоретическими основами и практическими навыками прове­дения аналитического скрининга необходимы провизору для последующей специализации в области судебно-химической экспертизы и клинической ток­сикологии.

II. Цель самоподготовки

Используя учебный и учебно-методический материал по токсикологиче­ской химии, а также знания и умения по базисным дисциплинам, изучить мето­ды предварительного разделения и обнаружения лекарственных средств.

III. Исходный уровень знаний

Студенты должны знать:

• физико-химические методы, используемые для разделения и обнаружения химических соединений, - хроматография в тонких слоях сорбента.

Студенты должны уметь:

• выполнять хроматографирование в тонких слоях сорбента;

• выполнять обработку хроматограммы цветореагентами и идентифицировать исследуемые соединения;

• рассчитывать абсолютную (Rf) и относительную (Rs) хроматографическую подвижность исследуемых соединений.

IV. План изучения темы

На занятии рассмотреть:

• способы предварительного обнаружения групп лекарственных соединений, экстрагируемых из кислой среды;

• условия ТСХ-скрининга лекарственных соединений кислотного и основного характера, способы обнаружения лекарственных средств на хроматограмме.

V. Рекомендуемая литература

1. Швайкова М.Д.. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С. 142-241.

2, Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств: Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / Под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 250 с.

3. Крамаренко В.Ф, Токсикологическая химия. - Киев: Выща школа, 1989. - С 20-22, 204-295,

4. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - Киев: Выща школа,

1982.-0.9-27,121-197.

5. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. - М.: Медицина, 1976. - С. 56-60.

6. Конспект лекций.

VI. Блок информации

Аналитический скрининг

Это научно обоснованная система поиска неизвестного вещества, когда в процессе последовательных операций поэтапно «отсеиваются» отдельные группы веществ и индивидуальные соединения.

Слово «скрининг» в переводе с английского означает «отсеивание».

Аналитический скрининг эффективен при диагностике комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе.

Требования к скрининговым методам:

• универсальность;

• специфичность для определенной группы веществ;

• высокая чувствительность (10"⁸ -10 "^!Ог в пробе);

• экспрессность и простота исполнения;

в возможность выполнения серийных анализов;

• возможность стандартизации и совершенствования методов за счет
использования новых материалов, оборудования, расширения списка анализируемых соединений.

 

 

Общий скрининг позволяет прово­дить групповую идентификацию при иссле­довании веществ, отличающихся по хими­ческому строению и относящихся к различ­ным фармакологическим группам.

Частный скрининг направлен на об­наружение веществ внутри группы и иден­тификацию ее отдельных представителей.

К скрининговым методам относятся:

• хроматографические,

• спектральные,

• иммунохимические.

ТСХ - скрининг

В ТСХ-скрининге используют системы рас­творителей:

• для алкалоидов опия частная система — этилацетат — метанол - 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1);

• для веществ из группы наркотических и одурманивающих средств, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций - толуол - ацетон - этанол - 25% раствор гидроксида аммония (45:45:7,5:2,5).

Детектирование (проявление) соедине­ний проводят последовательно. Для фракции А:

• 5% раствор сульфата ртути в концентрированной серной кислоте – барбитураты (белые зоны);

• 0,01% раствор дифенилкарбазона (ДФК) в хлороформе — барбитураты (сине- фиолетовые зоны);

• 10% раствор хлорида железа (III) - производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин - красно-оранжевая зона);

• реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

• для барбитуратов частная система — хлороформ — н-бутанол — 25% раствор

• для веществ кислотного, нейтрального и слабо основного характера, содер­жащихся в «кислом» извлечении (фракция А), - хлороформ-ацетон (9:1);

• для веществ основного характера, содержащихся в «щелочном» извлечении (фракция Б), - диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор гидроксида ам­мония (47,5:45:5:2,5);

 

гидроксида аммония	(70:40:5);
Хроматографическая подвижность I соединений фракции Б в общей системе растворителей на пласти­нах Silufol
Название лекарственного средства	R		Rs
Пахикарпин		0,12		0,23
Атропин		0,15		0,29
Эфедрин		0,18		0,35
Хинин		0,25		0,49
стрихнин		0.25		0,49
Этапиразин		0.51		1,00 |
Антипирин		0,54		1,06
Кофеин		0,56		1,10
Хлозепид		0,63		1.25
Дипразин		0,66		1,30
Производные ПАБК		0,70		1,37
Тиоридазин		0,72		1,41
Аминазин		0,75		1,47
Нитразепам		0,77		1,51
Амидопирин		0.83		1,63
Тизерцин		0,87		1,71
Диазепам		0,95		1,87

 

Для фракции Б:

 

- 10% раствор хлорида железа (III) — производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин — красно-оранжевая зона), производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- хлорная кислота концентрированная, содержащая 5% раствор нитрита натрия (97:3) — производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- 10% раствор серной кислоты - хинин (голубая флуоресценция в УФ-свете)

- реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография. Высокая эффективность метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а высокая чувствительность и экспрессность — более тонкого слоя сорбента.

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография. Достоверность определения по­вышается за счет хроматографирования на колонках, обладающих различной полярностью. Комитет по судебной токсикологии предлагает использовать ко лонки с неподвижными жидкими фазами SE-3O, OV-17, OV- 225. Детектор ио­низации пламени.

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. ВЭЖХ или жидкостная хроматография высокого давления является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, где элюент подается на колонку под большим дав­лением, что ускоряет проведение анализа. В качестве детекторов могут быть использованы: спектрофотометрический с переменной (190-700 нм) или фикси­рованной (254 нм) длинной волны, рефрактометрический, флуори-метрический, ионизации пламени, масс-спектрометрический, электрохимический и т.д. Иден­тификацию веществ проводят по параметрам удерживания и спектрам погло­щения.

Иммунохимические методы

В основе методов лежит специфическая реакция «антиген-антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. Спе­цифическим реагентом является антитело, которое вырабатывается как реакция на внедрение чужеродного вещества. При взаимодействии антигена-яда со спе­цифичным к нему реактивом-антителом образуется комплекс, который выпада­ет в осадок. Количественно оценить результаты реакции позволяют введение специальных меток. В зависимости от природы метки и способа детектирова­ния выделяют:

• радиоиммунный анализ,

• иммуноферментный (иммуноэнзимный) анализ,

• поляризационный флюороиммунный анализ,

• люминесцентный иммуноанализ.

Иммуноэнзимный метод получил наибольшее распространение. В каче­стве метки для антигенов используют ферменты - различные оксидазы, спо­собные количественно окислять специальное химическое вещество - хромо-генный субстрат - с образование окрашенных продуктов.

Иммунохимические методы анализа обладают высокой чувствительно­стью, специфичностью, экспрессностью, простотой исполнения. Реакции про­водятся непосредственно в биологических жидкостях и позволяют одновре­менно диагностировать большое число проб.

VII. Вопросы для самоконтроля

1. Какие этапы включает в себя предварительное исследование? В чём

цель предварительного исследования?

2. Какие химические реакции используются для предварительного обнаружения производных барбитуровой кислоты, пиразолона-5, фенотиазина?

3. Укажите особенности оформления пластинки в ТСХ-скрининге лекарственных и наркотических средств.

4. Объясните цель нанесения на пластинку двух стандартов и двух, порций экстракта в соответствующие зоны пластинки.

Какие стандарты-метчики используются при хроматографическом скрининге экстракта из кислой среды, из щелочной среды?

6. подвижных фаз, используемых в ТСХ-скринкнге.

7. Какие реактивы, и в какой последовательности применяют для обнаружения средств кислотного характера, обнаружения средств основного характера?

8. Что представляет собой реактив Драгендорфа? В чём суть и цель модификации реактива Драгендорфа?

9. Объясните термин «аналитический скрининг».

10.Какие требования предъявляются к скрининговым методам?

VIII. Задания, обязательные для выполнения

ТСХ-скрини нг экстракта из щелочной среды

Заполнить таблицы: ТСХ-с крининг экстракта из кислой среды

IX. План работы на занятии

Работа на занятии состоит из этапов:

• обсуждение основных этапов исследования лекарственных соединений;

• рассмотрение условий ТСХ-скрининга лекарственных соединений кислотного и основного характера;

• рассмотрение методов обнаружения лекарственных средств на хрома то грамме;

• проведение ТСХ-исследования лекарственных средств изучаемых групп.

X. Лабораторная работа

Проводят хроматографическое исследование хлороформных экстрактов на наличие лекарственных средств. В качестве подвижных фаз используют об­щие системы для ТСХ-скрининга веществ кислотного и щелочного характера-Условия хроматографирования приведены в блоке информации.

Проводят обработку хроматограмм соответствующими цветореагентами.

Рассчитывают хроматографическую подвижность (Rf) исследуемых ле­карственных средств и сравнивают их с табличными значениями.

I. Мотивация цели

Широкое применение лекарственных средств и, в частности, производ­ных барбитуровой кислоты в медицинской практике создает условия для воз­никновения отравлений в результате их неквалифицированного или немеди­цинского использования. Овладение техникой и методиками анализа лекарст­венных соединений является необходимым при освоении химико-токсикологических методов исследования.

II. Цель самоподготовки

Используя учебный и учебно-методический материал по токсикологиче­ской химии, а также знания и умения по базисным дисциплинам, изучить мето­ды исследования лекарственных средств кислотного, нейтрального и слабоос­новного характера, выделенных из объектов биологического происхождения.

VI. Блок информации

Производные барбитуровой кислоты

Всасывание производных барбитуровой кислоты начинается в желудке, где они находятся в недиссоциированной форме, и заканчивается в кишечнике. Барбитураты, хорошо растворимые в липидах (барбамил, этаминал), всасыва­ются в течение 15-20 мин, а плохо растворимые (барбитал и фенобарбитал) вса­сываются в течение нескольких часов. Максимальная концентрация в крови наблюдается через 4-8 и 12-18 часов. Наиболее опасны препараты короткого действия, так как токсическая концентрация может возникнуть уже через 30-60 мин. Барбитураты средней продолжительности действия (барбамил, этаминал) связываются с белками крови на 50-60%. Для препаратов длительного действия (фенобарбитал, барбитал) связывание достигает 5-15%.

Следы барбитала и фенобарбитала в моче могут быть обнаружены на протяжении 8-12 дней. Элиминация этаминала заканчивается в течение 3-4 дней.

При отравлении барбитуратами уменьшается диурез, замедляется пери­стальтика кишечника, снижается секреция желудочного сока, раскрываются сфинктеры. Обычно снижается температура тела.

К смертельному исходу при отравлении приводит тяжелая гипоксия, со­провождающаяся отеком легких, отеком мозга, почечной недостаточностью, гибелью клеток головного мозга.

VIII. Задания, обязательные для выполнения

Составить схему исследования по направлению:

1.Провести судебно-химическое исследование при подозрении на отрав­
ление производными барбитуровой кислоты.

2.Провести судебно-химическое исследование при подозрении на отрав­
ление производными пиразолона-5.

3.Заполнить таблицу:

 

МКС-реакции	производных	барбитуровой	кислоты
Производные			Реактивы
барбитуровой
кислоты		Фо	эма кристаллов
1.						1 1
2.
3.
4.

IX. План работы на занятиях

Работа на занятии 1 состоит из этапов:

• обсуждение вопросов токсичности и метаболизма производных барби­туровой кислоты;

• обсуждение методик предварительного и подтверждающего исследова-

ния на производные барбитуровой кислоты химическими методами;

• проведение цветных и МКС реакций на производные барбитуровой ки-

слоты. Работа на занятии 2 состоит из этапов:

• обсуждение методик и проведение определения количественного со­держания производных барбитуровой кислоты в изоляте спектрофото-метрическим методом;

• тестовый контроль по вопросам предварительного исследования ве-

ществ кислого характера. Работа на занятии 3 состоит из этапов:

• рассмотрение вопросов токсичности и метаболизма производных пира-золона-5;

• практическая работа по обнаружению производных пиразолона-5;

«тестовый контроль по вопросам предварительного исследования ве­ществ основного характера.

X. Лабораторная работа

Обнаружение производных барбитуровой кислоты Предварительные исследования

1. Реакция с нитратом кобальта.

Бумагу, импрегнированную раствором нитрата кобальта, смачивают ис­следуемым экстрактом, содержащим производное барбитуровой кислоты, под­сушивают, держат над парами аммиака. Бумага окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

2. ТСХ-скрининг.

Система растворителей: хлороформ-ацетон (9:1). Способы детекции:

- 5% раствором сульфата ртути;

- раствором 0,01% дифенилкарбазона в хлороформе.

Подтверждающие исследования

1. Мурексидная проба.

В фарфоровую чашку к сухому остатку, полученному после выпаривания хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта при комнатной температуре, прибавляют 3 капли 3% раствора перекиси водорода и 3 капли ре­актива, содержащего соль Мора и хлорид аммония. Содержимое чашки выпа­ривают на электроплитке и сухой остаток нагревают до появления белых паров. После охлаждения прибавляют 3 капли б н. раствора гидроксида аммония. При наличии производных барбитуровой и тиобарбитуровой кислот появляется ро­зовая окраска.

Следует обратить внимание, что кофеин даёт подобную реакцию. *

2. Реакция с концентрированной серной кислотой (МКС).

На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в капле концентрированной серной кислоты, помещенной на пред­метное стекло. Через 3-5 мин рядом помещают каплю дистиллированной воды и капилляром соединяют их. Через 10-20 мин под микроскопом наблюдают по­явление кристаллов кислотной формы.

(^ЗуРеакция с хлорцинкйодом (МКС).

На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 1 каплю раствора хлорцинкйода. Через 10-15 мин под микроско­пом наблюдают форму образовавшихся кристаллов.

2?)Реакпия со смесью хлорида железа и йодида калия (МКС).

На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 1 каплю раствора железойоидного реактива (смесь хлорида железа и йодида калия). Через 10-15 мин под микроскопом наблюдают форму образо­вавшихся кристаллов.

5. Реакция с дииодокупратом калия в растворе йода (МКС).

На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 1 каплю дииодокупрата калия в растворе йода. Через 10-15 минут под микроскопом наблюдают форму образовавшихся кристаллов.

6. Поглощение в УФ-области.

Кюветы спектрофотометра заполняют раствором барбитурата (рН=Ю) и буферным раствором (рН=10), снимают спектр поглощения. Максимум погло­щения наблюдают в интервале длин волн 235-245 им.

В кюветы спектрофотометра с раствором барбитурата (рН=10) и буфер­ным раствором (рН=10) добавляют по 1-2 капли концентрированной соляной кислоты до рН=2, перемешивают стеклянной палочкой и снимают спектр по­глощения, Наблюдают плавное снижение оптической плотности в интервале длин волн 220-260 нм.

В кюветы спектрофотометра с раствором барбитурата (рН=10) и буфер­ным раствором (рН=10) добавляют по 1-2 капли концентрированного (4 н.) рас­твора натрия гидроксида до рН=13, перемешивают стеклянной палочкой и сни­мают спектр поглощения. Максимум поглощения наблюдают в интервале длин волн 255-265 нм.

Обнаружение производных пиразолона-5 Предварительные исследования

1. Реакция с хлоридом железа.

На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта и выпаривают досуха, к сухому остатку прибавляют каплю 1% раствора хлорида железа. При наличии амидопирина по­является фиолетовая окраска, исчезающая от избытка реактива; антипирина -оранжево-красная; анальгина— синяя.

2. ТСХ-скрининг.
Система растворителей:

хлороформ-ацетон (9:1), при исследовании экстракта из кислой среды.

Способы детекции:

- 5% раствором хлорида железа,

- реактивом Драгендорфа.

Подтверждающие исследования

1. Реакция с нитратом серебра.

В пробирку или выпарительную чашку вносят 3-5 капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта, выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют каплю воды и 1-2 капли реактива и нагревают на водяной бане в течение 3-5 мин. Появляется фиолетовая (амидопирин) или сине-зелёная (анальгин) окраска раствора.

2. Реакция с нитритом натрия.

В пробирку или выпарительную чашку вносят 3-5 капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта, выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют каплю воды и каплю 10% раствора нитрита натрия. Появ­ляется фиолетовое окрашивание, быстро исчезающее при добавлении избытка реактива (амидопирин) или устойчивая зелёная окраска (антипирин). Анальгин с 1% раствором нитрита натрия даёт синее окрашивание.

3. Реакция с серной и фуксинсернистой кислотами.

В пробирку или выпарительную чашку вносят 3-5 капель хлороформного раствора исследуемого вещества или экстракта, выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют по капле воды, концентрированной серной и хромотропо-вой кислот. При наличии амидопирина наблюдается красное окрашивание, анальгина - красно-фиолетовое.

4. Лигниновая проба.

Хлороформный раствор исследуемого вещества или экстракт наносят на газетную бумагу в присутствии соляной кислоты. Наблюдают жёлто-оранжевое окрашивание при наличии анальгина.

 

 

I. Мотивация цели

Широкое применение лекарственных средств и, в частности, производ­ных фенотиазина, пара-аминобензойной кислоты, 1,4-бензодиазепина, средств из группы алкалоидов в медицинской практике создает условия для возникно­вения отравлений в результате их неквалифицированного или немедицинского использования. Овладение техникой и методиками анализа лекарственных со­единений является необходимым при освоении химико-токсикологических ме­тодов исследования.

II. Цель самоподготовки

Используя учебный и учебно-методический материал по токсикологиче­ской химии, а также знания и умения по базисным дисциплинам изучить мето­ды исследования лекарственных средств основного характера выделенных из объектов биологического происхождения.

IV. План изучения темы

На занятии 1 рассмотреть:

• вопросы токсичности и метаболизма производных 1,4-бензодиазепина;

• схемы исследования.

На занятии 2 рассмотреть:

вопросы токсичности и метаболизма производных фенотиазина;

• вопросы токсичности и метаболизма производных пара-аминобензойной кислоты;

• схемы исследования.

На занятии 3, рассмотреть:

• вопросы токсичности и метаболизма алкалоидов;

• схемы исследования;

приёмы и методы, используемые в экспресс-анализе наркотических соединений и диагностике наркоманий.

V. Рекомендуемая литература

1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия, - М: Медицина, 1975. - С. 160-236.

2. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств: Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / Под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 250 с.

3. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - Киев: Выща школа, 1989. - С. 235-294.

4. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - Киев: Выща школа, 1982. - С. 42-46, 136-196.

5. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. - М.: Медицина, 1976. - С. 74-124.

6. Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления. - М.: Медицина, 1989.-С. 254, 263-272.

7. Конспект лекций.

VI. Блок информации

Обнаружение кокаина

Для обнаружения кокаина проводят микрокристаллоскопические реак­ции.

1. Реакция с перманганатом калия (МКС). После удаления хлороформа сухой остаток на предметном стекле растворяют в капле 10%-го раствора соля­ной кислоты и жидкость испаряют при комнатной температуре. Затем к сухому остатку прибавляют каплю 1%-го раствора перманганата калия. Под микроскопом наблюдают кристаллы розово-фиолетового цвета в виде прямоугольных пластинок и сростков из них.

Реакция с платинохлористоводородной кислотой (МКС). Сухой остаток на предметном стекле после удаления хлороформа растворяют в капле 0,1 н. раствора соляной кислоты и добавляют каплю 10% раствора платинохлористо­ водородной кислоты. Под микроскопом наблюдают сростки кристаллов в виде перистых депдритов светло-желтого цвета.

Тема 2: ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ

I. Мотивация цели

Судебно-химическая экспертиза складывается из предварительного и подтверждающего исследований. Цель предварительного исследования - вы­явить наличие или отсутствие лекарственных средств в органических экстрак­тах с использованием скрининговых методов.

Овладение теоретическими основами и практическими навыками прове­дения аналитического скрининга необходимы провизору для последующей специализации в области судебно-химической экспертизы и клинической ток­сикологии.

II. Цель самоподготовки

Используя учебный и учебно-методический материал по токсикологиче­ской химии, а также знания и умения по базисным дисциплинам, изучить мето­ды предварительного разделения и обнаружения лекарственных средств.

III. Исходный уровень знаний

Студенты должны знать:

• физико-химические методы, используемые для разделения и обнаружения химических соединений, - хроматография в тонких слоях сорбента.

Студенты должны уметь:

• выполнять хроматографирование в тонких слоях сорбента;

• выполнять обработку хроматограммы цветореагентами и идентифицировать исследуемые соединения;

• рассчитывать абсолютную (Rf) и относительную (Rs) хроматографическую подвижность исследуемых соединений.

IV. План изучения темы

На занятии рассмотреть:

• способы предварительного обнаружения групп лекарственных соединений, экстрагируемых из кислой среды;

• условия ТСХ-скрининга лекарственных соединений кислотного и основного характера, способы обнаружения лекарственных средств на хроматограмме.

V. Рекомендуемая литература

1. Швайкова М.Д.. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С. 142-241.

2, Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств: Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / Под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 250 с.

3. Крамаренко В.Ф, Токсикологическая химия. - Киев: Выща школа, 1989. - С 20-22, 204-295,

4. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - Киев: Выща школа,

1982.-0.9-27,121-197.

5. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. - М.: Медицина, 1976. - С. 56-60.

6. Конспект лекций.

VI. Блок информации

Аналитический скрининг

Это научно обоснованная система поиска неизвестного вещества, когда в процессе последовательных операций поэтапно «отсеиваются» отдельные группы веществ и индивидуальные соединения.

Слово «скрининг» в переводе с английского означает «отсеивание».

Аналитический скрининг эффективен при диагностике комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе.

Требования к скрининговым методам:

• универсальность;

• специфичность для определенной группы веществ;

• высокая чувствительность (10"⁸ -10 "^!Ог в пробе);

• экспрессность и простота исполнения;

в возможность выполнения серийных анализов;

• возможность стандартизации и совершенствования методов за счет
использования новых материалов, оборудования, расширения списка анализируемых соединений.

 

 

Общий скрининг позволяет прово­дить групповую идентификацию при иссле­довании веществ, отличающихся по хими­ческому строению и относящихся к различ­ным фармакологическим группам.

Частный скрининг направлен на об­наружение веществ внутри группы и иден­тификацию ее отдельных представителей.

К скрининговым методам относятся:

• хроматографические,

• спектральные,

• иммунохимические.

ТСХ - скрининг

В ТСХ-скрининге используют системы рас­творителей:

• для алкалоидов опия частная система — этилацетат — метанол - 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1);

• для веществ из группы наркотических и одурманивающих средств, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций - толуол - ацетон - этанол - 25% раствор гидроксида аммония (45:45:7,5:2,5).

Детектирование (проявление) соедине­ний проводят последовательно. Для фракции А:

• 5% раствор сульфата ртути в концентрированной серной кислоте – барбитураты (белые зоны);

• 0,01% раствор дифенилкарбазона (ДФК) в хлороформе — барбитураты (сине- фиолетовые зоны);

• 10% раствор хлорида железа (III) - производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин - красно-оранжевая зона);

• реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

• для барбитуратов частная система — хлороформ — н-бутанол — 25% раствор

• для веществ кислотного, нейтрального и слабо основного характера, содер­жащихся в «кислом» извлечении (фракция А), - хлороформ-ацетон (9:1);

• для веществ основного характера, содержащихся в «щелочном» извлечении (фракция Б), - диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор гидроксида ам­мония (47,5:45:5:2,5);

 

гидроксида аммония	(70:40:5);
Хроматографическая подвижность I соединений фракции Б в общей системе растворителей на пласти­нах Silufol
Название лекарственного средства	R		Rs
Пахикарпин		0,12		0,23
Атропин		0,15		0,29
Эфедрин		0,18		0,35
Хинин		0,25		0,49
стрихнин		0.25		0,49
Этапиразин		0.51		1,00 |
Антипирин		0,54		1,06
Кофеин		0,56		1,10
Хлозепид		0,63		1.25
Дипразин		0,66		1,30
Производные ПАБК		0,70		1,37
Тиоридазин		0,72		1,41
Аминазин		0,75		1,47
Нитразепам		0,77		1,51
Амидопирин		0.83		1,63
Тизерцин		0,87		1,71
Диазепам		0,95		1,87

 

Для фракции Б:

 

- 10% раствор хлорида железа (III) — производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин — красно-оранжевая зона), производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- хлорная кислота концентрированная, содержащая 5% раствор нитрита натрия (97:3) — производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- 10% раствор серной кислоты - хинин (голубая флуоресценция в УФ-свете)

- реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография. Высокая эффективность метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а высокая чувствительность и экспрессность — более тонкого слоя сорбента.

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография. Достоверность определения по­вышается за счет хроматографирования на колонках, обладающих различной полярностью. Комитет по судебной токсикологии предлагает использовать ко лонки с неподвижными жидкими фазами SE-3O, OV-17, OV- 225. Детектор ио­низации пламени.

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. ВЭЖХ или жидкостная хроматография высокого давления является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, где элюент подается на колонку под большим дав­лением, что ускоряет проведение анализа. В качестве детекторов могут быть использованы: спектрофотометрический с переменной (190-700 нм) или фикси­рованной (254 нм) длинной волны, рефрактометрический, флуори-метрический, ионизации пламени, масс-спектрометрический, электрохимический и т.д. Иден­тификацию веществ проводят по параметрам удерживания и спектрам погло­щения.

Иммунохимические методы

В основе методов лежит специфическая реакция «антиген-антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. Спе­цифическим реагентом является антитело, которое вырабатывается как реакция на внедрение чужеродного вещества. При взаимодействии антигена-яда со спе­цифичным к нему реактивом-антителом образуется комплекс, который выпада­ет в осадок. Количественно оценить результаты реакции позволяют введение специальных меток. В зависимости от природы метки и способа детектирова­ния выделяют:

• радиоиммунный анализ,

• иммуноферментный (иммуноэнзимный) анализ,

• поляризационный флюороиммунный анализ,

• люминесцентный иммуноанализ.

Иммуноэнзимный метод получил наибольшее распространение. В каче­стве метки для антигенов используют ферменты - различные оксидазы, спо­собные количественно окислять специальное химическое вещество - хромо-генный субстрат - с образование окрашенных продуктов.

Иммунохимические методы анализа обладают высокой чувствительно­стью, специфичностью, экспрессностью, простотой исполнения. Реакции про­водятся непосредственно в биологических жидкостях и позволяют одновре­менно диагностировать большое число проб.

VII. Вопросы для самоконтроля

1. Какие этапы включает в себя предварительное исследование? В чём

цель предварительного исследования?

2. Какие химические реакции используются для предварительного обнаружения производных барбитуровой кислоты, пиразолона-5, фенотиазина?

3. Укажите особенности оформления пластинки в ТСХ-скрининге лекарственных и наркотических средств.

4. Объясните цель нанесения на пластинку двух стандартов и двух, порций экстракта в соответствующие зоны пластинки.

Какие стандарты-метчики используются при хроматографическом скрининге экстракта из кислой среды, из щелочной среды?

6. подвижных фаз, используемых в ТСХ-скринкнге.

7. Какие реактивы, и в какой последовательности применяют для обнаружения средств кислотного характера, обнаружения средств основного характера?

8. Что представляет собой реактив Драгендорфа? В чём суть и цель модификации реактива Драгендорфа?

9. Объясните термин «аналитический скрининг».

10.Какие требования предъявляются к скрининговым методам?

VIII. Задания, обязательные для выполнения

ТСХ-скрини нг экстракта из щелочной среды

Заполнить таблицы: ТСХ-с крининг экстракта из кислой среды

IX. План работы на занятии

Работа на занятии состоит из этапов:

• обсуждение основных этапов исследования лекарственных соединений;

• рассмотрение условий ТСХ-скрининга лекарственных соединений кислотного и основного характера;

• рассмотрение методов обнаружения лекарственных средств на хрома то грамме;

• проведение ТСХ-исследования лекарственных средств изучаемых групп.

X. Лабораторная работа

Проводят хроматографическое исследование хлороформных экстрактов на наличие лекарственных средств. В качестве подвижных фаз используют об­щие системы для ТСХ-скрининга веществ кислотного и щелочного характера-Условия хроматографирования приведены в блоке информации.