Імунологічні методи визначення статі ембріонів, використання ДНК-зонду, полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Імунологічні методи. Стать ембріонів може бути встановлена ідентифікацією HY-антигену за допомогою антитіл до HY-антигену. Виявлення зв'язування антитіл до HY-антигену з чоловічими ембріонами здійснюється двома методами:

-      характерною рисою першого, більш простого методу, є культивування клітин ембріонів у середовищі з комплементом, що приводить до лізису клітин ембріонів чоловічої статі;

-      більш практичним є другий метод, що не ушкоджує ембріони, сутність якого полягає в одержанні і використанні вторинних флуоресцентних антитіл до антигену HY. Ефективність цього методу стосовно до ембріонів великої рогатої худоби складає 85-87% .

Перспективним підходом до ранньої діагностики статі ембріонів великої рогатої худоби є створення специфічного для ДНК Y-хромосоми молекулярного зонда. Для його одержання виділену з лімфоцитів бугая ДНК розщеплюють за допомогою спеціальних ферментів — рестриктаз. На наступному етапі отримані фрагменти ДНК вводять до складу самореплікующихся елементів - плазмід. Для цього очищені молекули плазмидної ДНК розрізають за допомогою тієї же рестриктази і гібридизують із фрагментом ДНК бугая, що приводить до з'єднання комплементарних липких кінців ДНК бугая і плазміди. Гібридні молекули, що створилися під дією ферменту лигази і складаються з хромосомної і плазмідної ДНК, вводять в оброблені спеціальним образом бактеріальні клітини з метою їх розмноження — клонування. Потім гібридні молекули ДНК виділяють з бактерій і розрізають знову за допомогою тієї же самої рестриктази, виділяючи, таким чином, клоновані фрагменти хромосомної ДНК — основу зонда. З метою з'ясування наявності комплементарних послідовностей нуклеотидів, виділені з декількох клітин ембріонів великої рогатої худоби ДНК гібридизують з радіоактивно міченої клонованої ДНК-зондом, після чого методом радіоавтографії виявляють ділянки хромосом, що зв'язують зонд. Можливості використання цього методу розширилися після розробки способів мічення зондів флуоресцентними барвниками, наприклад, біотипом. Дослідження препаратів ембріональних клітин під мікроскопом дозволяє відрізнити чоловічі клітини, ядра яких здобувають буре або чорне забарвлення, від жіночих (ядра не фарбуються).

В даний час спосіб визначення статі доімплантаційних ембріонів за наявністю або відсутністю Y-хромосоми за допомогою специфічного для ДНК Y-хромосоми зонда є самим точним. Його ефективність для ембріонів великої рогатої худоби складає 100%, однак цей метод вимагає великих витрат часу. Аналіз відомої послідовності ДНК Y-хромосоми дозволяє виявити також деякі хромосомні порушення, наприклад, наявність у клітинах ембріона двох Y-хромосом.

Становить інтерес визначення статі ембріонів великої рогатої худоби шляхом культивування in vitro 2-5 кліток компактизованих ембріонів. Цей метод заснований на тім, що при додаванні в спеціальне середовище клітини ембріонів чоловічої статі, на відміну від ембріонів жіночої статі, добре розмножуються, що дозволяє вже через 3 години після початку аналізу зробити висновок про стать ембріона. Ефективність цього методу складає 90-95%.

Нещодавно був розроблений новий ефективний спосіб відбору ембріонів великої рогатої худоби за статтю перед їх трансплантацією із застосуванням полимеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що забезпечує ампліфікацію специфічних повторюваних послідовностей ДНК Y-хромосоми (потім ДНК піддають електрофорезу в 2%-м агарозному гелі, що фарбують бромистим етидіїм і досліджують під ультрафіолетовим світлом). ПЛР дозволяє по єдиному бластомеру, взятому шляхом біопсії, встановити стать доімплантаційного ембріона з дуже високою точністю (95,4%); за відносно короткий час. Ця методика може бути застосована для досить великої кількості ембріонів; біопсія клітини за допомогою мікроманіпуляторів не впливає на здатність ембріонів до розвитку in vitro і частоту їх приживаності в порівнянні з контрольними ембріонами.

49.Партеногенез, види зародків, що створюються при партеногенезі, методи активації партеногенезу.

Партеногенез — розмноження жіночої гамети без участі ядра гамети чоловічої статі. Таке явище інколи спостерігають у ящірок та птиці, зокрема індиків. У США Олсен провів широкі дослідження по стимуляції партеногенезу в белтсвіллських білих індиків. Він вперше довів можливість селекції по збільшенню частоти партеногенезу. Так, якщо на початку досліджень тільки у деяких яйцях ділення починалося без запліднення, то в кінці таких яєць було від 6 до 12 %. Близько 10 % ембріонів вижили і від них одержали доросле потомство. При цьому всі індики були самцями. Одержання партеногенетичних самців має велике значення, оскільки вони гомозиготні за всіма парами генів, а тому не несуть летальних генів і являють собою цінний матеріал для схрещування та гібридизації. У індиків жіноча стать гетерогаметна (ZW). Тому самка має половину ооцитів із Z-статевою хромосомою, а половину – із W-статевою хромосомою. При партеногенетичному розвитку яєць відбувається подвоєння хромосом в ооцитах, що містять Z-хромосому, що призводить к утворенню зиготи ZZ, з якою і створюються життєздатні самці з нормальним для них набором статевих хромосом. При подвоєнні хромосом типа W створюються зиготи, а потім і ембріони з набором хромосом WW, тобто позбавленні Z-хромосоми. Такі особі є нежиттєздатними. Одержати партеногенетичних самок поки не вдалося, хоча ймовірність їх одержання має більшу частоту. Практично питання використання партеногенезу вирішено позитивно у шовкопряда завдяки працям Б. Л. Астаурова і X. Хасімото, В. А. Струнникова. Цього досягли впливом високих і низьких температур та іонізуючої радіації на запліднені яйцеклітини. У випадку, коли гинуть жіночі ядра, таку різновидність безстатевого розмноження називають андрогенезом, а якщо чоловічі — партеногенезом. У шовкопряда великі дози фізичних і хімічних факторів призводять до амейотичного партеногенезу, коли одержують самок, що повністю копіюють генотип матері. При малих дозах цих факторів стимулюється мейотичний партеногенез, де розвиваються тільки самці, повністю гомозиготні за всіма генами.

Активація ооцитів тварин приводить до різних шляхів партеногенетичного розвитку.

1. Завершення другого мейотичного поділу може привести до виділення одного гаплоїдного набору хромосом у виді полярного тельця і формування єдиного пронуклеуса з іншого. Потім у гаплоідном пронуклеусі відбувається реплікація ДНК і яйцеклітина поділяється на два бластомери з гаплоїдними наборами хромосом. Ці зародки називають «генетично однорідними гаплоїдами», тому що їх гомологічні хромосоми генетично ідентичні.

2. Ооцит, завершивши перший розподіл дозрівання, замість утворення другого полярного тельця (тобто минаючи другий мейотичний розподіл) вступає в дроблення — поділяється на дві однакові за розмірами гаплоїдні клітини, у кожній з яких формується пронуклеус (негайне дроблення). Внаслідок того, що розподіл відбувається після кросинговеру, і обидва гаплоїдних набори не є генетично ідентичними, зародки називають «мозаїчними гаплоїдами».

3. Після метафази другого розподілу дозрівання і розбіжності хромосом цитотомія не здійснюється (друге полярне тільце не виділяється), у результаті чого відбувається формування двох гаплоїдних пронуклеусів. Після цього в одних випадках ооцит поділяється на два бластомери — «мозаїчний гаплоїд», а в інших, після реплікації ДНК, формування метафазної пластинки і розподілу дроблення, розвивається гетерозиготний партеногенетичний диплоїд (гетерозиготність обумовлена кросинговером).

4. Ооцит не проходить другого розподілу дозрівання, і хромосоми формують один великий диплоїдний пронуклеус. Після реплікації ДНК і наступного дроблення утвориться гетерозиготний (наслідок кросинговеру) партеногенетичний диплоїд.

5. Відбувається нормальний мейоз із двома розподілами, після чого гаплоїдний набір хромосом яйцеклітини формує єдиний пронуклеус, який після подвоєння свого хромосомного набору поділяється на два гаплоїдних ядра. Ці ядра зливаються, утворюють одне диплоїдне ядро, розвивається гомозиготний диплоїд. Різновидом цього шляху розвитку, властивого шовковичному шовкопрядові, є утворення диплоїдного пронуклеуса в яйцеклітині ссавця після мікрохірургічного видалення чоловічого пронуклеуса і штучної диплоїдизації жіночого пронуклеуса зиготи, що залишився.

6. Цілком придушується редукційний розподіл або виділення першого полярного тільця (в останньому випадку хромосоми полярного тільця поєднуються з хромосомами ооциту). Далі відбувається розподіл, що приводить до розбіжності сестриних хроматид. У результаті в шовковичного шовкопряда утворюються два генетично ідентичних диплоїдних пронуклеуси (у деяких представників гетерогаметної статі), з одним із яких зв'язаний подальший розвиток: після реплікації ДНК яйцеклітина поділяється на два бластомери, кожний з яких містить диплоїдний набір хромосом. Розвивається гетерозиготний партеногенетичний диплоїд, генотип якого ідентичний генотипові матері (амейотичний партеногенез).

Крім перерахованих шляхів розвитку стимульованих до партеногенезу ооцитів існують і інші. Так, у деяких яйцеклітин утворюється три пронуклеуси, може мати місце тетраплоїдний партеногенез, гаплоїдний зародок може перетворюватися в гапло-диплоїдний і ін.

Партеногенетична активація яйцеклітин ссавців залежить від багатьох факторів. Короткочасний вплив на свіже овульовані ооцити миші 7%-ним розчином етилового спирту протягом 1,3 і 5 хвилин викликає однаково високу частоту партеногенетичний активації - 64,6: 69,5 і 63,7% відповідно.

Метод активування партеногенезу, що щадить, - це культивування мишачих яйцеклітин в середовищі без іонів кальцію і магнію. Ефективним способом активації яйцеклітин ссавців є електростимуляція - при напруженості поля 1,5 кВ/год і тривалості імпульсу 100 мкс 78% яйцеклітин було активовано, 32% з них розвилося in vitro до стадії бластоцисты. Більшість активованих яйцеклітин мишей (84-100%) мало 2 пронуклеуса без другого полярного тельця, інші мали 1 пронуклеус із другим полярним тільцем або без нього.