Методы выявления факторов вирулентности - ферментов агрессии бактерий: лизоцима, гиалуронидазы, лецитовителлазы и др.

Гиалуронидаза. Гиалуронидазной активностью обладают S.aureus, S.pyogenes,, C.perfringens и др. Гиалуронидаза – экзофермент, разрушающий гиалуроновую кислоту, что обеспечивает прохождение бактерий через соединительную ткань. Для определения гиалуронидазы в опытную пробирку вносят бульонную исследуемую культуру бактерий, гиалуроновую кислоту, в контрольную – только гиалуроновую кислоту. После 20-минутной инкубации в термостате в обе пробирки добавляют 15%-ю уксусную кислоту. При наличии у микробов гиалуронидазы жидкость в опытной пробирке остается гомогенной, при отсутствии – появляется муцина. В контрольной пробирке сгусток муцина образуется всегда в результате взаимодействия гиалуроновой и уксусной кислот.

Лецитовителлаза (летициназа) – экзофермент S.aureus обеспечивающий выживание бактерий на коже, в очагах нагноения, расщепляет липопротеид оболочек клеток. Выявляется в виде помутнения или образования радужных венчиков вокруг колоний на желточно – солевом агаре.

Микробный лизоцим – фермент, оказывающий литическое действие на грамположительные микроорганизмы, участвует в аутолизе и делении бактериальной клетки, придает штамму-продуценту селективные преимущества при колонизации кожных покровов и слизистых. Для определения лизоцимной активности тест-микроба(микрококка) засевают на МПА сплошным газоном, сверху в виде бляшек наносят исследуемую культуру (S. aureus). Инкубируют при 37°С в течение 24 час. Появление зон лизиса микрококка вокруг культуры S. aureus свидетельствует о лизоцимной активности микроорганизмов (о лизисе штаммами S. aureus индикаторного штамма микрококков).

36 Методы определения персистентных свойств бактерий: антилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активностей

Факторы персистенции обеспечивают способность бактерий длительно переживать в организме путем защиты от механизмов иммунитета. К факторам персистенции относятся поверхностные структуры бактерий Антилизоцимную активность определяют по методике Бухарина О.В. Исследуемую культуру, напр. S. aureus, засевают на плотную питательную среду с лизоцимом в виде бляшек. Инкубируют при 37°С в течение 24 час. после чего выросшие колонии обрабатывают хлороформом и наносят второй слой агара с тест- культурой микрококка. Учет проводят после инкубации в термостате по росту микрококка вокруг культур, инактивировавших лизоцим, то есть вокруг S. aureus, обладающих антилизоцимной активностью (АЛА).

Определение антикомплементарной активности проводят по методу Бухарина О.В. Изучаемые культуры, напр., Enterobacterspp, выращивают в течение 18–24 часов при 37°С на питательном агаре. Выросшие колонии инактивируют парами хлороформа и на них наслаивают второй слой агара, содержащий комплемент (сыворотка крови). Данная двухслойная система инкубируется в течение 1 часа при 37°С, во время чего происходит реализация антикомплементарных свойств и продуктов жизнедеятельности исследуемой культуры. Результатом чего является инактивация комплемента вокруг колоний. В дальнейшем наслаивают третий слой питательного агара, содержащего индикаторной культуры Е.coli. После 16–18-часовой инкубации при 37°С, во время которой происходит выявление антикомплементарных свойств, проводят регистрацию результатов по росту индикаторного штамма вокруг исследуемых культур Enterobacter spp., где произошла инактивация комплемента.

Определение антиинтерфероновой активности. Исследуемые культуры, напр., Enterobacter spp, выращивают на питательной среде в присутствии лейкоцитарного интерферона, чашки инкубируют сутки, выросшие культуры инактивируют парами хлороформа, а затем на посев наслаивают агара, содержащего взвесь тест – культуры (Corynobacterium xerosis). Посевы инкубируют 24 часа при 37°С и определяют антиинтерфероновую активность микроорганизмов по наличию роста тест – культуры вокруг колоний испытуемых культур.

Реакция агглютинации (РА) на стекле.

РА на стекле - ориентировочная РА, наступающая в течении нескольких минут, применяется только с целью идентификации выделенной из организма больного чистой культуры бактерий по антигенной структуре.

В РА на предметном стекле, поставленной с целью идентификации возбудителя брюшного тифа по антигенной структуре участвуют 3 ингредиента:

1)выделенная чистая культура S.typhi на скошенном МПА? (корпускулярный АГ- агглютиноген);

2)диагностические видоспецифические антисыворотки с АТ-ми против S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B., полученные путем гипериммунизации кроликов соотвествующими бактериальными антигенами;

3)изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Паралелльно вставится три реакции на стекле:

а)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S.typhi + бактерии со скошенного агара;

б)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S. paratyphi A + бактерии со скошенного агара;

в)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S. paratyphi В + бактерии со скошенного агара;

Хорошо перемешать. Наличие агглютинации (выпадение хлопьев белого цвета) указывает на присутствие соответствующего возбудителя, при отрицательной - наблюдается равномерное помутнение (рис.27). Агглютинация – это склеивание бактериальных клеток под влиянием специфических антител.