Химико-токсикологические лаборатории Центров по лечению острых отравлений больниц и их задачи. Основные документы, регламентирующие деятельность лаборатории.

Говоря об организации работы ХТЛ в рамках стационарного лечебного учреждения, необходимо четко определить задачи, которые должна выполнять лаборатория. К ним прежде всего относятся экстренная круглосуточная качественная идентификация и количественное определение токсиканта в биосредах пациента,посколькуотэтогозависятпостановкадиагнозаотравления, выборметода, оценкаэффективностилечения. Соответственнолабораториядолжнабытьрасположенавпределахлечебногоучреждения, вкотороморганизованцентр (отделение),иметькруглосуточныйрежимработыинеобходимыедляэтогоштатноерасписаниеидиагностическоеоборудование.

ХТЛвыполняетисследованиябиологических объектов в целях диагностики отравления, оценки эффективности лечения, т.е, исследования следует отнести к категории клинических. Именно поэтому исследования в целях экспертизы или установления факта приема алкоголя, наркотических, лекарственных и других токсичныхвеществневходятвкругобязанностейХТЛ.

ХТЛ может проводить выполнение диагностических исследований для других отделений базовойбольницы, атакжеразличныхстационаровобслуживаемой территории принеобходимостидиагностикиилидифференциальнойдиагностикиотравленияубольных, госпитализированныхсразличнымизаболеваниями (комойнеяснойэтиологии, нейроинфекциями, нарушениеммозговогокровообращенияидр.),когдалечащиеврачи подозревают отравление. В этих случаях исследование проводят только после предварительной телефонной или очной консультации сврачом-токсикологом, которыйиопределитнеобходимость, обоснованностьинаправлениеисследования (переченьтоксичныхвеществили групп токсикантов,предполагаемыхвкачествепричиныотравления). Следуетзаметить, чтоХТЛнепроводитпоисктакназываемогонеизвестногояда, таккакдляэтогопотребуетсяцелыйрядразличныхпоисковыхиподтверждающихисследований, получение,помимообычных анализов крови и мочи, желудочного содержимого других объектов (кусочков органов), большего промежутка времени (до нескольких дней).Такиеисследованияотносятсяккомпетенциибюросудебно-медицинскойэкспертизы.

Деятельность лаборатории регламентируется специальными нормативными документами, в частности следующими приказами:

· М3 РФ от 05.10.1998 г.№ 289 «Обаналитическойдиагностикенаркотическихсредств, психотропныхидругихтоксическихвеществворганизмечеловека»,

· М3 РФ от 21.02.2000 г, № 64«Обутвержденииноменклатурыклиническихлабораторныхисследований»,

· М3РФот 07.02.2000 г. № 45 «О системе мер по повышению качества клиническихлабораторныхисследованийвучрежденияхздравоохраненияРФ».

Учитывая, что для определения различных лекарственных, в том числе психотропных и наркотических веществ, требуется иметь стандарты, лабораториядолжнаполучитьлицензиюнаосуществлениедеятельности, связаннойсоборотомнаркотическихсредствипсихотропныхвеществнаоснованиифедеральныйзаконаот 08.01.1998 г. №З-ФЗ«Онаркотическихсредствахипсихотропныхвеществах»,

Особенности проведения химико-токсикологического анализа в условиях оказания экстренной помощи больным с острыми отравлениями. Требования к анализу, выбор методов анализа. Комплексное использование методов для надежной диагностики.

В тех случаях, когда клинические проявления на ранних стадиях развития интоксикации не позволяют установить причину отравления, проводят качественные и количественные иссле­дования в возможно короткие сроки (максимум в течение 1—2 ч после поступления больного в стационар). Успех проведения ХТА при диагностике острых отравлений и, в конечном счете, успех лечения в значительной степени зависят от качества и скорости обмена информацией между клиницистом и химиком. Объем и глубина проведения ХТА в большинстве случаев определяется потребностями клиницистов. Подробное изучение клинической картины отрав­ления, характерных симптомов отравления отдельными ядами является одним из основных условий адекватного выбора методов ХТА. Поэтому химик-токсиколог должен знать главные симптомы острых отравлений различными токсикантами.

Для исследования биологических жидкостей, поступивших в химико-токсикологические или судебно-химические лаборатории, на каждое вещество потребовалось бы много времени и очень большое количество анализируемых объектов. Чтобы, во-первых, рационально расходовать биологические жидкости, присланные на исследование, во-вторых, сохранить время анализа химик-токсиколог должен составить хорошо продуманный план исследования и исключить многие вещества из этого плана.

Для составления плана ХТА большое значение имеют результаты предварительных проб, так называемые методы аналитического "скрининга" на наличие токсических веществ в исследуемых объектах. На основании результатов предварительных проб можно исключить ряд веществ из плана ХТА и предположить, какие вещества могут быть в биологическом материале.

На основании только предварительных проб нельзя сделать окончательный вывод о наличии предполагаемого вещества в исследуемом объекте. Для этой цели в ходе ХТА необходимо провести дополнительные исследования на это вещество с помощью соответствующих реакций и методов.

Поэтому при положительных результатах предварительных проб на определенные вещества исследование этих веществ, включается в план ХТА.

При отрицательном результате предварительных проб на соответствующие вещества дальнейшее исследование их не проводят и не включают в план ХТА.

Для обнаружения токсичных веществ в объектах, взятых у живых лиц, требуются быстровыполнимые методы анализа, т.к. результаты этих анализов необходимы не только судебным химикам, но и лечащим врачам для решения вопроса об оказании срочной медицинской помощи пострадавшим.

Требования, предъявляемые к химико-токсикологическому анализу в диагностике острых отравлений:

1. Время проведения – 1-2 часа.

2. Точность используемых методов (±10%), специфичность, высокая чувствительность. Этим требованиям отвечают следующие физико-химические методы анализа:

1. Хроматографические: ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ.

2. Спектральные методы: спектроскопия в УФ- и видимой областях спектра. Выбор метода анализа определяется физико-химическими свойствами токсических веществ, а также способами их выделения из биологической среды.

11.Отбор и подготовка проб при проведении химико-токсикологического анализа с диагностической целью. Жидкость-жидкостная и твердо-жидкостная экстракция (сорбция) на полимерах и силикагелях.

Отбор проб

Моча. Процедура отбора пробы должна производиться в условиях, исключающих подмену или замену ее другими жидкостями. Проба мочи собирается в прозрачный стеклянный широкогорлый градуированный сосуд объемом 300-600 мл. Объем пробы должен быть не менее 200 мл.

Кровь отбирается при строгом соблюдении асептических условий из поверхностной вены через иглу самотеком в сухой пенициллиновый флакон, содержащий раствор гепарина (3-5 капель на каждые 10 мл крови). Флакон тотчас же закрывают стандартной резиновой пробкой, фиксируют пробку, содержимое флакона сразу же перемешивают.

Слюна отбирается в стерильный сухой флакон из-под пенициллина в количестве 5 мл и тут же закрывается пробкой.

Волосы отбирают отдельно с лобной, теменной, затылочной, правой и левой височных областей волосистой части головы в виде пучка в количестве не менее 15-20 волос, которые обрезаются у корня ножницами как можно ближе к коже. При необходимости отбирают образцы волос с других волосистых участков тела.

Ногти отбирают отдельно с каждой руки или, при необходимости, с каждой ноги. Ногти обрезаются ножницами по возможности ближе к коже.

Отбор образцов потожировых выделений на руках и других участках тела производится ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом.

Подготовка объектов к изолированию ядовитых веществ

Внутренние органы измельчают до разме­ров кусочков 0,5×0,5×0,5 см. Естественно, что более мелкое измельчение приводит к уве­личению экстракционной поверхности и одновременно к значительному увеличению количества балластных эндогенных соединений в извлечении. При этом химик вынужден будет при­менить особые способы очистки, что приведет к потере токсических веществ, особенно при их следовых количествах в объекте.

Рекомендуется использовать также вымораживание объекта при температуре -30-40°С. При этом в органах образуются льдинки, которые разрывают клетки и способствуют выходу токсических веществ в окружающую среду.

Можно использовать лиофтизацию, т.е. высушивание объекта при низких темпера­турах в вакууме. Это приводит к потере объектом воды и получению при изолировании более чистых извлечений.

Если объект законсервирован спиртом, его осторожно удаляют. В случае подозрения на отравление летучими соединениями мышьяка, ртути объект подщелачивают перед удалением спирта карбонатом натрия.

Кровь. Ядовитые вещества и их метаболиты в крови находятся в свободном виде или могут быть связаны с белками (альбуминами, глобулинами). При пробоподготовке крови к экстракции используют приемы, позволяющие разрушить комплекс анализируе­мого вещества с белком. Для этой цели рекомендованы следующие методы.

Добавление к крови смешивающихся с водой органических растворителей (этило­вого, метилового спиртов, ацетонитрила, ацетона). Эффективность очистки от белков зависит от величины диэлектрической проницаемости (е) используемого растворителя. При понижении диэлектрической проницаемости сила притяжения между молекулами растворенных веществ возраста­ет. В результате под влиянием ацетона и спиртов (этилового и метилового) происходит агрегация молекул белковых веществ крови, понижается растворимость и происходит выпадение их в осадок.

Добавление химических агентов для коагуляции белков, кислот (трихлоруксусной, хлорной), солей тяжелых металлов (например, солей бария).

Термическая обработка крови. Этот метод используют для ядовитых веществ, ко­торые не разлагаются при повышенной температуре. Он не рекомендуется при анализе объекта, содержащего термолабильные соединения.

Моча. С мочой токсические вещества выделяются как в неизмененном состоянии, так и в виде метаболитов и конъюгатов. Пробоподготовка мочи к экстракции токсических веществ и их метаболитов включает проведение разрушения конъюгатов. Для этой цели проводят неспецифический кислотный или специфический ферментативный гидролиз.

Кислотный гидролиз является более быстрым и простым в осуществлении. Однако вследствие неспецифичности реакции расщепления ковалентной связи и жестких усло­вий проведения в среде концентрированной кислоты при кипячении в течение длитель­ного времени или при нагревании в автоклаве под давлением, образуется большое коли­чество побочных продуктов. Ферментативный гидролиз проводится в присутствии одного или смеси ферментов β-сульфатазы и β-глюкуронидазы в мягких условиях, что уменьшает образование по­бочных продуктов, и гидролизат получается более чистым. Существенным недостатком метода являются необходимость соблюдения строгих условий гидролиза.

Слюна. Для снижения активности ферментов слюну при хранении замораживают. Перед экстракцией ее разбавляют водой очищенной в отношении 1:3, после чего экстрагируют токсические вещества органическими растворителями при соответствующем значении pH.

Волосы, ногти. Для удаления внешних загрязнений волосы и ногти отмывают 2 М раствором хлороводородной кислоты и метанолом (или этанолом), затем сушат при ком­натной температуре и отбирают для анализа навеску 30—40 мг.

Жидкость-жидкостная и твердофазная экстракция. Экстракцией могут быть изолированы токсичные вещества, относящиеся к различным классам и группам химических соединений, в том числе нелетучие органические вещества: наркотики, ядовитые, сильнодействующие ле­карственные вещества, пестициды и др. Твердофазная экстракция обеспечивает концентрирование анализируемого соединения и удаление фоновых веществ с использованием специальных сорбентов. Очистка требуется только после проведения жидкость-жидкостной экстракции.

Основы построения общего (ненаправленного) химико-токсикологического анализа, проводимого с диагностической целью. ТСХ-скрининг мочи. Изолирование и хроматографическое обнаружение лекарственных средств на хроматограммах.

План ХТА определяется:

- Поставленными вопросами

- Данными сопроводительных документов (обстоятельства дела, выписка из истории болезни, акт судебно-медицинского вскрытия трупа и др.)

- Наружным осмотром объектов исследования (характер объекта, окраска, специфический запах, наличие посторонних включений, рН среды ).

Метод ТСХ получил широкое распространение благодаря своей доступности и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной избирательности (специфичности).

Тонкослойная хроматография применяется в системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных средств, имеющих токсикологическое значение.

В качестве неподвижной фазы используется силикагель, подвижной фазы - 7 различных систем растворителей. В общем скрининге чаще используют следующие системы растворителей:

1. для веществ кислотного, нейтрального и слабоосновного характера, извлекаемых органическим растворителем из кислого водного раствора (первая подгруппа), - хлороформ-ацетон (9:1);
2. для веществ основного характера, извлекаемых органическим растворителем из щелочных растворов (вторая подгруппа), - диоксан-хлороформ-ацетон-25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5);
3. в последнее время при анализе наркотических и одурманивающих веществ, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций используют универсальную систему растворителей толуол-ацетон-этанол-25% аммиак (45:45:7,5:2,5)

Методика разделения. Анализируемое вещество и метчик наносят на линию старта пластинки обычным капилляром в виде пятен диаметром 3-5 мм. (в качественном анализе) или микропипеткой и микрошприцем в виде узких полосок (в количественном анализе). Пластинки подсушивают и хроматографируют в выбранной системе растворителей, количество которой должно быть достаточным для образования слоя глубиной 0,5 см. После хроматографирования в хроматографических зонах проводят качественный и количественный анализ. Обнаружение веществ на хроматограмме: окрашенные вещества не требуют специального обнаружения (по собственной окраске), бесцветные - по флюоресценции в УФ-свете (морфин имеет сине-голубую, папаверин – желто-зеленую флюоресценцию) или по характерным реакциям с химическими реагентами, которые наносят на хроматограмму пульверизатором или капельным способом. Кроме того, проводят экстрагирование зоны веществ с сорбента подходящим растворителем с целью дальнейшего исследования полученных соединений, например физико-химическими методами.

Обработка результатов. Вычисляют величину Rf. Rf = а/в, где а – длина пробега анализируемого вещества, в – длина пробега растворителя (линия финиша). Обычно используют значение Rf • 100. Величина Rf является качественным параметром тонкослойной хроматографии и может быть физической константой, если эксперимент проводится в строго стандартных условиях. Чаще всего она характеризует эффективность разделения данной хроматографической системы. Более точную информацию дают относительные величины Rs (или Rx) - величины Rf исследуемого вещества, отнесенные к Rf стандартного соединения.

Организация службы аналитической диагностики наркоманий и токсикоманий. Основные документы, регламентирующие деятельность химико-токсикологических лабораторий. Задачи химико-токсикологического анализа.

Химико-токсикологическая лаборатория наркологического диспансера (наркологической больницы) (далее - ХТЛ) является структурным подразделением наркологического диспансера или наркологической больницы. Работа данной ХТЛ осуществляется в соответствии с Приказом Минздравсоцразвития РФ от 27.01.2006 N 40 "Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ".

ХТЛ организуется для проведения химико-токсикологических исследований биологических жидкостей организма человека (кровь, моча, слюна) на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов, а также альтернативных объектов (смывы с поверхности кожи, волосы, ногти и пр.) на наличие наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов (далее - биологические объекты).

ХТЛ возглавляется заведующим, который подчиняется главному врачу наркологического диспансера (наркологической больницы). Штаты ХТЛ укомплектовываются врачами, провизорами, специалистами с немедицинским образованием, допущенными к занятию должности врача клинической лабораторной диагностики в установленном порядке, имеющими сертификат по специальности "Клиническая лабораторная диагностика" и прошедшими дополнительную подготовку по аналитической токсикологии наркотических средств, психотропных и других токсических веществ.

ХТЛ располагается в отдельном, изолированном помещении, исключающем доступ посторонних лиц и отвечающем требованиям техники безопасности при работе персонала в ХТЛ и санитарно-гигиеническим требованиям, обеспечивающим выполнение возложенных на нее задач. ХТЛ оснащается необходимым оборудованием, оргтехникой, инвентарем, реактивами, справочной литературой, нормативно-технической документацией, средствами связи и охранной сигнализацией.

ХТЛ осуществляет следующие функции:

· Прием в установленном порядке на химико-токсикологические исследования биологических объектов.

· Хранение биологического объекта для повторных химико-токсикологических исследований в течение двух месяцев с соблюдением установленных для этого требований.

· Проведение химико-токсикологических исследований принятых биологических объектов на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов. Ведение рабочего журнала проводимых исследований в произвольной форме с описанием биологического объекта и результатов.

· Оформление результатов химико-токсикологических исследований о наличии (отсутствии) в исследуемых биологических объектах алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов по установленной форме.

· Выдача Справок о результатах химико-токсикологических исследований биологических объектов.

Контроль за деятельностью ХТЛ, расходом реагентов и правильным использованием оборудования осуществляется руководителем (заместителем руководителя) наркологического диспансера (наркологической больницы), структурным подразделением которого является ХТЛ.

Учетная форма N 452/у-06 "Направление на химико-токсикологические исследования" (далее - Направление) заполняется и выдается структурными подразделениями медицинских организаций, проводящих медицинское освидетельствование на состояние опьянения и (или) диагностику факта употребления алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов (далее - Подразделение) в случаях, когда требуется лабораторное подтверждение или исключение наличия алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов в биологических объектах.

На основании Направления ХТЛ проводит химико-токсикологические исследования и выдает Справку о результатах химико-токсикологических исследований (учетная форма N 454/у-06) о наличии или отсутствии алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов в представленном на химико-токсикологические исследования биологическом объекте.

Направление на химико-токсикологические исследования заполняется и подписывается работником Подразделения, производившим отбор биологического объекта. Направления хранятся в ХТЛ в течение одного года, после чего уничтожаются.

14.Особенности химико-токсикологического анализа средств, вызывающих одурманивание. Требования к анализу, основные этапы анализа. Объекты исследования. Отбор и подготовка проб к анализу.

Особенности химико-токсикологического анализа средств, вызывающих одурманивание:

1) Целью этого анализа является установление факта присутствия НС независимо от найденного количества вещества.

2) В ХТА психоактивных веществ существует 2 направления:

а) судебно-правовое (установление факта присутствия наркотических средств);

б) клиническое (диагностика, лечение).

Основные этапы анализа

1. Подготовка проб биологического материала к анализу

2. Выбор методов анализа

3. Собственно анализ: обнаружение и количественное

определение одурманивающего вещества

4. Интерпретация результатов анализа

Подготовка проб биоматериала к анализу Самыми распространенными приемами выделения НС из различных видов биоматериала остается жидкость-жидкостная экстракция и сорбция. Для мочи допускается прямое концентрирование путем упаривания. Особый подход имеется к подготовке волос и ногтей к анализу. Обязательно проведение 2 стадий:

1) предварительное исследование поверхности объектов на присутствие определяемых веществ

2) проведение очистки поверхности этих объектов с целью удаления веществ, мешающих дальнейшему исследованию.

Очистка доступной зоны волос, где могут находиться любые вещества (в том числе НС) из окружающей среды. Эти вещества связаны с биологическим материалом волос слабыми межмолекулярными связями, поэтому удаляются при отмывании безводным этанолом или изопропанолом. Очистка частично доступной зоны волос, в которой находятся вещества эндогенного или экзогенного происхождения из пота и плазмы крови, проводят многократным промыванием растворителям, приводящим к набуханию ткани волос. В качестве таких растворителей чаще всего используют воду или смесь вода + спирт. В недоступную зону волос в обычных в условиях НС не могут проникнуть из внешней среды. Именно в этой зоне после разрушения структуры волос проводят обнаружение НС.