Идентификация пиков на хроматограмме

 

Идентификация – отнесение пиков на хроматограмме к тому или иному компоненту из списка. При этом производится сравнение рассчитанных параметров удерживания всех обнаруженных на хроматограмме пиков с информацией, хранящейся в таблице компонентов.

Составляется список всех возможных пар (пик – компонент), для пиков попадающих в осна поиска компонентов. Таким образом, в построенном списке один пик может претендовать на несколько компонентов и наоборот.

Составленный список сортируется по удовлетворению критерия выбора пика в окне компонента. Критерии сортировки: близость по шкале времени или индекса. Этот критерий, а так же приоритетность идентификации опорных и обычных пиков задается в диалоге Идентификация последовательности операций Расчет хроматограммы.

Из отсортированного списка пар идентифицируются опорные пики. Компонент считается идентифицированным, если в списке пар присутствуют одноименные подтверждающие для него компоненты. При отсутствии пиков-претендентов для подтверждающих компонентов, идентификация пика не производится. После идентификации опорных пиков пересчитываются ожидаемые параметры удерживания (время, индекс) для обычных и всех прочих пиков.

Наиболее простой способ идентификации – сравнение времени удерживания анализируемого компонента с временем удерживания известного соединения при строго заданных условиях анализа. Для проведения идентификации пика по времени удерживания в таблице компонентов используются следующие поля:

- название компонента;

- время удерживания;

- окно поиска по времени, %.

Окно поиска – границы области, в которой будет осуществляться поиск пика, как в положительную, так и в отрицательную сторону от заданного в таблице параметра удерживания.

На хроматограмме пик присваивается тому компоненту, заданное время удерживания которого наиболее близко к реальному времени пика.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

 

Основное оборудование

В работе используется хроматографический комплекс «Хроматэк кристалл 5000» (рис. 3.1.) включающий:

- пламенно-ионизационный детектор;

- колонку хроматографическую насадочную из нержавеющей стали длиной 5 м, внутренним диаметром 3 мм, внутренняя составляющая колонки 10% ПЭГ 1000 Сферохром;

Рис. 6. Принципиальная схема «Хроматэк кристалл 5000»

 

-программное обеспечение (ПО) «Хроматэк Аналитик» для сбора и обработки хроматографической информации, поступающей с хроматографа.

  ПО «Хроматэк Аналитик» позволяет:

- осуществлять автоматизированный сбор и хранение хроматографической информации;

- выполнять обработку хроматографической информации с выдачей результатов анализов;

- оформлять отчеты по выполненным анализам в соответствии с требованиями пользователя;

- преобразовывать хроматографические данные в различные файловые форматы для использования этих данных в программах других производителей;

- выполнять различные узкоспециализированные расчеты по конкретным аналитическим задачам.

 

Материалы

В работе для проведения хроматографического анализа используются легкие углеводороды – октан, толуол, бензол и ундекан. Для идентификации пиков используют:

- стандартные смеси:

         - 40% октан+60% толуол;

         -20% бензол + 80% ундекан;

- исследуемый образец, содержащий октан, толуол, бензол и ундекан произвольного состава (задаётся преподавателем);

- шприц вместимостью 10 мкл с ценой деления 0,1 мкл;

- ацетон для промывки микрошприца.

 

Подготовка к анализу

4.3.1.Включить и подготовить к работе хроматограф, генератор водорода, компрессор, баллон для подачи газа-носителя (азот) в соответствии с инструкциями по эксплуатации.

4.3.2. Для запуска соединения выполнить двойной щелчок мышью на ярлыке соединения, расположенном на рабочем столе. Программа Панель управления подключится к хроматографу, после чего будет запущена программа Хроматэк Аналитик 2.6. (рис.7.)

После загрузки программы Хроматэк Аналитик 2.6 в меню Метод выберите команду – Запустить метод или на боковой панели инструментов нажмите соответствующую кнопку (рис. 8, 9, 10).

 

Рис. 7. Запуск соединения с хроматографом

Рис.8. Выбор команды

«Запустить метод»

Настроить параметры режима хроматографа в соответствии с табл. 1. Прибор будет готов к работе после того, как на хроматографе загорится зеленый сигнал «ГОТОВНОСТЬ».

4.3.3. Подготовить микрошприц для набора пробы. Для этого необходимо его промыть ацетоном и исследуемой жидкостью (не менее двух раз каждым). Затем «продуть» шприц воздухом подсоединив его к специальной трубке для «продувания», которая прикреплена к компрессору (продолжительность операции 2 минуты).

 

Выберите из списка метод, который необходимо загрузить и нажмите ОК
Рис.9. Запуск метода

 

 

 

Рис.10. Хроматограф в состоянии готовности

 

4.3.4. Отобрать пробу испытуемого образца объёмом 0,5 мкл в микрошприц.

Примечание: При образовании пузырьков воздуха в микрошприце при отборе пробы необходимо их удалить. Для этого шприц держать вертикально иглой вверх, на кончик шприца аккуратно надеть резиновую прокладку и слегка надавить на поршень шприца до полного удаления воздуха из пробы.

 

Таблица 1

Режим работы хроматографа

Параметр	Значение параметра
Канал старта	15 минут
ПИД	Температура [150°C] Расход водорода [25 мл/мин]              Расход воздуха [250 мл/мин]
Термостат колонок	Температура [85°C]
Колонка «10% ПЭГ 100 Сферохром»	Расход [30 мл/мин] Газ-носитель Азот
Испаритель	Температура [120°C]

 

Проведение испытания

 

Последовательно провести хроматографический анализ стандартных проб для идентификации пиков, а затем два параллельных испытания (для расчета погрешности испытания) исследуемой смеси неизвестного состава (задается преподавателем).

4.3.1. Подготовленную пробу испытуемого образца объёмом 0,5 мкл ввести в испаритель.

4.3.2. Включить «Старт» и провести анализ в течении 20 минут. По мере проведения анализа на экране будет строиться хроматограмма. При старте анализа на экране появляется паспорт хроматограммы. Поля паспорта помимо обязательной информации могут содержать и дополнительную, такую как фамилия оператора, описание колонки, различные комментарии (рис. 11.).

По номеру группы происходит объединение хроматограмм для расчета средних значений и сходимости. Поэтому хроматограммы являющиеся параллельными измерениями одной пробы, должны иметь одинаковый номер группы. При необходимости номер хроматограммы и группы можно скорректировать вручную (рис.12.).

 

Рис.11. Паспорт хроматограммы

 

 

 

Рис.12. Корректировка паспорта хроматограммы вручную

 По окончании анализа хроматограф автоматически перейдет в режим Подготовка и на экране монитора будет видна вся хроматограмма. Далее необходимо провести идентификацию пиков методом сравнения времени удерживания анализируемого компонента с временем удерживания известного соединения при строго заданных условиях анализа.

Для этого рекомендуется оценить разметки пиков, величину и характер шумов нулевой линии.

По умолчанию автоматически устанавливается масштаб, при котором видна вся хроматограмма. Для того чтобы оценить характер хроматограммы у подножия пиков, необходимо воспользоваться операциями масштабирования, которые выполняются с помощью мыши и клавиатуры.

Для того чтобы увеличить участок хроматограммы, нажмите левую кнопку мыши в одном из углов интересующей области и, не отпуская, переместите указатель мыши в противоположный угол. После отпускания выбранная область будет увеличена (рис. 13.).

Рис.13. Выделение рамкой области хроматограммы

 

Масштабирование хроматограммы с помощью мыши удобно сочетать с ТОльзованиием курсорных кнопок клавиатуры (рис. 14).

 

Рис.14. Использование курсорных кнопок клавиатуры

 

Для того чтобы вернуться к отображению на экране всей хроматограммы:

- или выполните на любом месте хроматограммы двойной щелчок мыши;

- или нажмите клавишу ENTER (страница Хроматограмма должна быть активна).

В случае многоканальной хроматограммы графики каналов располагаются один под другим. При этом один из каналов рисуется поверх остальных и является активным. Оси с надписями, отображаемые слева и снизу, относятся только к активному каналу, так как в общем случае масштабы каналов могут не совпадать и вообще иметь разные единицы измерения. Координаты указателя мыши, отображаемые в строке состояния программы, также относятся к активному каналу. Переместить канал наверх и, следовательно, сделать его активным можно щелкнув мышью на его графике.

С помощью настройки параметров операции Интегрирование не всегда удается добиться автоматической корректной разметки пиков на хроматограмме. Для устранения этой проблемы прямо на графике можно визуально откорректировать положение характерных точек пика (рис.15.).

Для того чтобы изменения в разметке вступили в силу, нажмите на кнопку выполнить расчет .

Если в канале хроматограммы присутствуют пики, созданные или измененные вручную, то автоматического обнаружения новых пиков в данном канале не производится.

После проведения ручной корректировки пиков на хроматограмме, при выполнении Расчета хроматограммы, операция Интегрирование не производит поиск новых пиков, а только пересчитывает площади и высоты существующих. Это сделано для того чтобы вся работа по ручной корректировке пиков, выполненная во время текущего анализа не была сведена на нет автоматической разметкой по его окончании.

 

 

Рис. 15. Ручная корректировка разметки пиков

 

Для того чтобы производилось автоматическое обнаружение новых пиков на хроматограмме не должно быть пиков, скорректированных вручную. Если возникла необходимость провести автоматическую разметку после процедуры ручной корректировки, все пики нужно удалить.

Для удаления пиков в меню Хроматограмма | Операции выберите одноименную команду или на панели инструментов нажмите соответствующую кнопку  (рис. 16.).

 

 

Рис.16. Удаление разметки пиков

 

Операцию Удаление пиков с критерием Неидентифицированные удобно включать в последовательность Расчет хроматограммы после операции Идентификация.

Разметка пика может быть удалена вручную (рис. 17.).

 

 

Рис. 17. Удаление разметки пиков вручную

 

Расчет хроматограммы выполняется автоматически при завершении записи хроматограммы.

Оператор может выполнить его вручную в любой момент записи, нажав на панели инструментов кнопку  - Выполнить расчет или на клавиатуре компьютера F9.

Выполнять расчет необходимо каждый раз при каких-либо изменениях в хроматограмме.

Результат расчета хроматограммы и результат расчета средних выводятся на соответствующих закладках главного окна (рис. 18.).

 

Рис. 18. Результат расчета хроматограммы

 

Для создания отчета по хроматограмме в меню Метод выберите команду Отчет или нажмите на панели инструментов соответствующую кнопку .

Для создания отчета – по средним – в меню Метод выберите команду Отчет по средним или нажмите на панели инструментов соответствующую кнопку  (рис. 19.).

 

 

Рис. 19. Отчет. Общие настройки

 

Сохранение отчетов очень удобно, поскольку по истечении времени отчет ранее снятого анализа может быть вновь востребован. Если поиск нужной хроматограммы вызывает затруднения (или она вообще была удалена), сохраненный отчет может быть распечатан в любое время без использования программы Хроматэк Аналитик 2.6. Для этого достаточно найти на диске нужную папку, выбрать в ней файл Analytic 2.0 Report. Htm, запустить его и, в открывшейся программе Microsoft Internet Explorer, выбрать в меню Файл команду Печать (рис. 20.).

 

 

Рис. 20. Отчет. Разделы отчета

 

График хроматограммы можно распечатать как целиком, так и по частям. В случае необходимости распечатки части графика нажмите кнопку Добавить столько раз, сколько участков графика требуется распечатать. Задайте для каждого участка время (в столбцах Слева и Справа) и амплитуду (в столбцах Сверху и Снизу). В столбце Датчик укажите нужный канал хроматограммы. По умолчанию печататься будут все каналы хроматограммы (рис. 21.).

 

Рис.21. Отчет. График хроматограммы

 

Обработка результатов

 

5.1. Полученные результаты внести в таблицу 2.

5.2. Рассчитать процентное содержание веществ в пробе по формуле:

 

 (1)

где:

С_{2 i} – процентное содержание i-го компонента в исследуемой пробе;

А_{2 i ср} – среденее значение площади пика i-го компонента в исследуемой пробе;

С_{1 i} - процентное содержание i-го компонента в стандартной пробе;

А_{1 i} – площадь пика i-го компонента в стандартной пробе.

5.3. Определить относительную и абсолютную погрешность полученных результатов по формулам:

                                                                   (2)

                                                                   (3)

5.4. Сравнить полученные результаты с истинными значениями, результаты внести в табл. 3.

5.5. Сделать выводы по работе.

Таблица 2

Результаты хроматографического анализа

Вещество	Стандартная  проба			Испытуемая проба
	Содержание в пробе, С1i, %	Площадь пика, А1i, мВ*мин	Время выхода t, мин	Площадь пика, мВ*мин			Время выхода			Содержание в пробе, С2i,%
				В первом испытании (А2I i)	Во втором испытании (А2II i)	Среднее значение (А2iср)	В первом испытании,tI, мин	Во ТОром испытании, tII, мин	Среднее значение, tср,, мин

 

Таблица 3

Расчет погрешности испытания

Вещество	Истинное содержание в пробе, С, %	Расчетное содержание в пробе, С2,%	Абсолютная погрешность, D,%	Относительная погрешность, d,%	Максимальное значение абсолютной погрешности, Dmax,%	Максимальное значение относительной погрешности, dmax,%

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Что такое хроматография?

2. Какие виды хроматографии существуют? В чем их главное отличие?

3. В газовой хроматографии, что выступает в качестве подвижной фазы, неподвижной фазы?

4. Перечислите преимущества газовой хроматографии.

5. Какой инертный газ используется в данном методе и почему?

6. Опишите общее устройство газового хроматографа.

7. Расскажите принцип действия пламенно-ионизационного детектора. Почему в данном методе применялся ПИД?

8. Какие дополнительные газы необходимы для работы ПИД? В каком соотношении они должны подаваться в ПИД?

9. Что такое режим работы прибора? На что он влияет? Как изменится общий вид хроматографических пиков, если увеличить температуру в колонке и увеличить расход газа?

10. Какова последовательность методики определения процентного содержания углеводородов в смеси? Что такое стандартная проба?

 

Б иблиографический список

1. Ягодовский, В.Д. Адсорбция [Электронный ресурс]: В.Д.Ягодовский. – Эл. изд. – Элек. Текст. Дан. (1файл pdf: 219 с.) – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015.- (учебник для высшей школы). – Систем. требования: Adobe Reader XI; Экран 10”. ISBN 978-5-9963-2929.

2. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа [Текст]: учебник: в 2 т. Т. 1 / [Ю. М. Глубоков, В. А. Головачева, В. И. Дворкин и др.]; под ред. А. А. Ищенко. – М.: Академия, 2010. – 352 с.: ил., граф., схемы, табл. – (Высшее проф. Образование: Химические технологии).

 

РЕШЕНИЕ ТИПОВЫХ ЗАДАЧ

Пример 1

Определить массовую долю компонентов газовой смеси по следующим данным:

Компонент смеси	Пропан	Бутан	Пентан	Циклогексан
S, мм2	175	203	182	35
k	0,68	0,68	0,69	0,85

Решение: расчёты проводим по методу внутренней нормализации, согласно которому

,

где  _i – массовая доля i- го компонента в смеси, %;