Методика исследования фитонцидов

Исследования проводились весной 2021года в кабинете биологии общеобразовательной школы № 16 города Саранска.

Исследовательская работа включала в себя ряд этапов:

1. Подготовка и стерилизация микробиологической посуды.

2. Приготовление искусственной питательной среды.

3. Выращивание микроорганизмов методом осаждения из воздуха.

4. Получение бактериальной культуры и посев.

5. Закладка опыта по влиянию фитонцидов растений на развитие микроорганизмов.

Оборудование и материалы: чашки Петри, колбы объёмом от 100 мл, пипетки от 1 до 10 мл, спиртовки, химические стаканы, предметные и покровные стёкла, микроскоп, специальные бактериологические иглы, петли, шпатели, вата, марля, бумага обёрточная, бумага фильтровальная, карандаши по стеклу; растительные ткани чеснока, лука, липы, яблока.

Ход работы:

1. Подготовка и стерилизация микробиологической посуды.

Лабораторную посуду (чашки Петри, колбы, стаканы, пипетки) моют в горячем мыльном растворе, ополаскивают чистой водой и сушат на воздухе. Затем чашки завёртывают в обёрточную бумагу и помещают в сушильный шкаф при температура не выше 100 - 105⁰ С градусов на 1,5 – 2 часа. Специальные иглы, петли, шпатели прокаливают на пламени спиртовки.

2. Приготовление искусственной питательной среды.

Питательную среду готовят в стерильных колбах. К 50 мл дистиллированной воды добавляют 2,5 г глюкозы, 1,5 г пептона и 2 г агара. Оставляют полученный раствор для набухания. Далее колбы закрывают стерильными ватными пробками и в таком виде стерилизуют содержимое трехкратным кипячением на водяной бане с промежутками между кипячением в 15-20 часов. Полученную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри, так чтобы было покрыто дно чашки.

3.Выращивание микроорганизмов методом осаждения из воздуха

После застывания питательной среды чашки открывают на 10 -15 минут, затем закрывают, заворачивают в бумагу и инкубируют в термостате при температуре 25-30⁰ С. Споры или клетки микроорганизмов, содержащиеся в воздухе, оседают на поверхности питательной среды, прорастают, делятся и образуют скопления, называемые колониями. Через неделю поверхность агара в чашках Петри покрыта растущими колониями микроорганизмов.

4. Получение бактериальной культуры и посев.

    Клетки бактерий, которые относят, к одному виду называют – чистая культура. Для ознакомления с губительным действием фитонцидов на микроорганизмы засевают чашки Петри с питательной средой сплошным газоном какой-либо бактерии, например, сарциной. Для этого на поверхность застывшего агара наносят каплю суспензии данной бактерии. Суспензию готовят, размешивая небольшое количество бактериальной массы в 20 мл дистиллированной воды. Шпателем равномерно растирают суспензию на поверхности чашки Петри с питательной средой.

5. Выявление растений с наибольшей фитонцидной активностью.

На посеянный материал помещаем ткани растений (лук, чеснок, лимон и др.), чашки закрываем. Опытные чашки помещают в термостат при 25-30⁰ С (можно при комнатной температуре). Через несколько дней учитывают результаты опыта. Повторность опыта трехкратная.

 

 

Результаты исследования

Методом осаждения из воздуха на питательной среде нами были получены и промикроскопированы бактерии рода сарцина – Sarcina. Она же использовалась в качестве чистой культуры при тестировании фитонцидной активности разных растений.

Колонии Sarcina окрашены в синий или фиолетовый цвет, диаметр колоний 4-5 мм. Sarcina имеет форму кокков, клетки средних размеров (2-6 мкм), встречаются скоплениями по 4-8 клеток вместе. Sarcina – аэроб, широко распространенный в почве и воздухе, разлагает мочевину и белок.

По истечении времени на поверхности агаровой среды по всей чашке вырастает сплошной газон посеянной сарцины, а вокруг разложенных тканей растений появляются прозрачные зоны отсутствия роста бактерий. Такие зоны образуются вследствие того, что фитонциды растений диффундируют в агар и задерживают рост бактерии. Измеряя диаметр каждой такой прозрачной зоны, можно определить какие растения в большей степени подавляют рост сарцины.

По нашим данным наибольший фитонцидный эффект имеет чеснок, чистая зона у него составляла 3,5 см (см. таблица 1). Несколько меньший диаметр свободного от бактерий агара наблюдался у лимона (2,8 см). Лук обладал еще меньшим размером чистой зоной – 1,5 см. Чистая зона яблока составила 0,7 см.

Таблица 1

№ п / п	Вид растения	Диаметр прозрачной зоны (см)
1.	Чеснок	3,5
2.	Лук	1,5
3.	Липа	2,8
4.	Яблоко	0,7

Заключение

Фитонциды – биологически активные вещества, основным свойством которых является подавление жизнедеятельности или даже гибель многих болезнетворных микроорганизмов. Они являются природными антибиотиками, которые человек научился использовать в практических целях.

Проведенное нами исследование по изучению влияния действия фитонцидов некоторых растений на распространенные микроорганизмы (бактерии рода сарцины), подтвердили эти сведения. Однако наши результаты показали, что наряду с такими растениями как лук и чеснок, также очень сильным фитонцидным действием обладает и липа. При выращивании бактерий в фитонцидной среде фактор влияния определялся по образованию чистой не заросшей бактериальной массой округлой зоны вокруг разложенных тканей изучаемых растений. Чем больше диаметр этой зоны, тем сильнее действие фитонцидов данного растения. По наши данным оказалось, что степень воздействия изучаемых растений не одинакова. Максимально это воздействие проявилось у чеснока и липы, лук занимает лишь третье место. Полученные результаты позволили убедиться в эффективном действии фитонцидов и подтвердили ценные фитонцидные свойства данных растений.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Все изученные растения Республики Мордовия обладают антибиотическим действием на микроорганизмы.

2. Максимально это свойство проявляется у чеснока и липы, чуть меньше у лука.

3. Рекомендовать обучающимся употреблять в пищу растения с наиболее высокими фитоцидными свойствами (чеснок, липа, лук), с целью профилактики вирусных и бактериальных заболеваний.