Правила работы в микробиологической лаборатории

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

     Работа в микробиологической лаборатории медицинского ВУЗа осуществляется с микроорганизмами - возбудителями инфекционных заболеваний. Поэтому для предупреждения заражения студенты и персонал обязаны строго соблюдать правила внутреннего распорядка:

1. Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, сменной обуви и шапочках. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен.

2.  Во время работы необходимо:

· Соблюдать меры предосторожности при работе с источником открытого огня.

· Не касаться микробиологических препаратов руками.

· Для взятия чистой культуры микроорганизма из пробирки или чашки Петри использовать стерильные бактериальные петли, для чего перед использованием их прожигать в верхнем пламени горелки до красного накаливания.

· В течение работы весь инструмент и пробирки с посевами держать в штативе.

· Держать рабочее место в чистоте. При случайном попадании заразного материала на стол, пол и др. это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором.

· После работы все инструменты (пинцеты, шпатели, бактериальные петли) прожечь в пламени горелки.

· По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ _______________________________

 

 

A.   Таксономия бактерий

 

   Прокариотические микроорганизмы (таблица1.) разделяют на две большие группы: эубактерии (в эту группу входят также все патогенные бактерии) и архебактерии (эволюционно отличные от эубактерий организмы). Царство Прокариоты разделено на эволюционно связанные таксоны: отделы, классы, порядки, семейства, роды и виды. Одной из основных таксономических категорий является вид. Вид - это совокупность микроорганизмов, обладающих сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и генетическими свойствами, но отличающихся от других представителей рода. Название вида согласно бинарной номенклатуре состоит из двух слов. Первое слово - название рода, которое пишется с прописной буквы, второе слово обозначает видовой эпитет и пишется со строчной буквы. Оба слова пишутся на латинском языке курсивом. При повторном написании вида в тексте, родовое название может быть сокращено до начальной буквы, например Escherichia coli обычно пишут как E. coli.

А. Нативные препараты

     Данные препараты используют для изучения живых неокрашенных бактерий. Наиболее распространены методы «висячей» капли (рис.2.), исследование в темном поле и фазово-контрастная микроскопия. Подобные приемы применяют, например, для диагностики сифилиса или предварительной диагностики диарей, вызванных кампилобактерами, а также для определения подвижности

 

Рис. 2. Метод «висячей» капли. Каплю с культурой бактерий помещают на покровное стекло. Затем покровное стекло переворачивают и помещают над предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазаны вазелином для предотвращения растекания материала.

микроорганизмов (например, Vibrio cholerae). Метод «висячей» капли часто используется совместно с темнопольной микроскопией, что обеспечивает наилучшее выявление микробной подвижности. 

 

В. Окрашенные препараты

 

 

Неокрашенные микроорганизмы плохо видны и труднодифференцируемы. Поэтому чаще используется микроскопия окрашенных препаратов. Способны окрашиваться только фиксированные (мертвые) ткани. В практической микробиологии наиболее распространена термическая фиксация. Это метод достаточно грубый, но сохраняет морфологию бактерий. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. В то же время, для тканей человека используют более мягкие способы фиксации: метиловым спиртом или смесью «этиловый спирт-эфир» (смесь Никифорова). Приготовление фиксированного препарата (мазка) идет по следующей схеме (рис.3).

Рис. 3. Приготовление фиксированного мазка.

(а) - приготовление мазка  (b) - фиксация мазка

(с) - окрашивание  (d) - просмотр препарата с использованием иммерсионного объектива.

 

 

Практическая работа: этапы приготовления фиксированного мазка

а) Приготовление мазка.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени спиртовки (до красного накаливания). Приготовить тонкий мазок на стекле с помощью стерильной бактериальной петли. Для этого, на обезжиренное предметное стекло нанести каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую бактериальной петлей внести исследуемый материал и распределить его таким образом, чтобы получить тонкий (не слишком плотный) и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то его непосредственно нанести петлей на предметное стекло и приготовить мазок. Снова простерилизовать петлю.

b) Фиксация мазка. Мазки высушить на воздухе или над пламенем спиртовки в струе теплого воздуха. После высушивания необходимо зафиксировать бактерии. Для фиксации, предметное стекло (мазком вверх) медленно провести 4 раза (в течение 4 секунд) через пламя горелки. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур и изменить их отношение к восприятию красителей. Стекло необходимо держать пинцетом во время термической фиксации препарата.

 

C) Окрашивание мазка.

Препарат окрашивают одним или несколькими красителями (см. раздел C: Методы окрашивания бактерий).

 

Рис. 4. Принцип иммерсионной микроскопии (объяснение в тексте).

Окраска по Граму.

Среди методов окраски микроорганизмов наибольшее значение имеет метод Грама, по отношению к которому все бактерии можно разделить на три группы (таб. 2.): грамположительные, грамотрицательные и кислотоустойчивые бактерии (плохо воспринимают окраску по Граму). Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Отношение к окраске по Граму является важным диагностическим признаком при определении бактерий и всегда упоминается при их характеристике. Различие в реакции на окраску по методу Грама объясняется особенностями структуры клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые по-разному удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом. Генциановый фиолетовый (основной краситель) и йод входят в клеточную стенку и прочно связываются с ней. Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет толстый, многослойный пептидогликан, кроме того, проницаемость клеточной стенки грамположительных микроорганизмов меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных микроорганизмов

Таблица 2. Сравнительная характеристика клеточной стенки грамположи

               тельных, грамотрицательных и кислотоустойчивых бактерий.

Характеристика	Грамположительные бактерии (Гр+)	Грамотрицательные бактерии (Гр-)	Кислотоустойчивые бактерии
Пептидогликан	Многослойный	Один слой	Относительно небольшое          количество
Тейхоевые кислоты	+	_	_
Наружная мембрана	_	+	_
Липополисахарид (эндотоксин)	_	+	_
Липиды	Небольшое             количество	Липополисахариды	Миколовые кислоты и гликолипиды
Пили	_	+	_

 

создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом. Грамотрицательные бактерии имеют тонкий пептидогликановый слой, который теряет генциановый фиолетовый после обработки спиртом, становясь бесцветным. Дополнительное окрашивание карболовым фуксином (вторая окраска) делает грамотрицательные бактерии, красными или розовыми (рис. 5).

  Бактерии, не имеющие пептидогликана (например, микоплазмы) или имеющие восковой внешний слой (например, микобактерии) не окрашивают по методу Грама.

 

 

Рис. 5. Принцип окраски по методу Грама.

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

     Работа в микробиологической лаборатории медицинского ВУЗа осуществляется с микроорганизмами - возбудителями инфекционных заболеваний. Поэтому для предупреждения заражения студенты и персонал обязаны строго соблюдать правила внутреннего распорядка:

1. Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, сменной обуви и шапочках. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен.

2.  Во время работы необходимо:

· Соблюдать меры предосторожности при работе с источником открытого огня.

· Не касаться микробиологических препаратов руками.

· Для взятия чистой культуры микроорганизма из пробирки или чашки Петри использовать стерильные бактериальные петли, для чего перед использованием их прожигать в верхнем пламени горелки до красного накаливания.

· В течение работы весь инструмент и пробирки с посевами держать в штативе.

· Держать рабочее место в чистоте. При случайном попадании заразного материала на стол, пол и др. это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором.

· После работы все инструменты (пинцеты, шпатели, бактериальные петли) прожечь в пламени горелки.

· По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ _______________________________

 

 

A.   Таксономия бактерий

 

   Прокариотические микроорганизмы (таблица1.) разделяют на две большие группы: эубактерии (в эту группу входят также все патогенные бактерии) и архебактерии (эволюционно отличные от эубактерий организмы). Царство Прокариоты разделено на эволюционно связанные таксоны: отделы, классы, порядки, семейства, роды и виды. Одной из основных таксономических категорий является вид. Вид - это совокупность микроорганизмов, обладающих сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и генетическими свойствами, но отличающихся от других представителей рода. Название вида согласно бинарной номенклатуре состоит из двух слов. Первое слово - название рода, которое пишется с прописной буквы, второе слово обозначает видовой эпитет и пишется со строчной буквы. Оба слова пишутся на латинском языке курсивом. При повторном написании вида в тексте, родовое название может быть сокращено до начальной буквы, например Escherichia coli обычно пишут как E. coli.