Осаждение ферментов органическими растворителями

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 3

1.ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ.. 5

1.1. Факторы, влияющие на осаждение ферментов. 6

1.2. Установки для осаждения ферментов. 9

1.3. Примеры осаждения органическими растворителями. 11

2.ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ РАСТВОРАМИ СОЛЕЙ (ВЫСАЛИВАНИЕ) 12

2.1. Описание процесса высаливания. 12

2.2. Факторы, влияющие на процесс. 13

2.3. Какие соли используются. 14

2.4. Проведение процесса высаливания. 15

3.ОСАЖДЕНИЕ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ.. 17

4.ПРИМЕР ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ.. 18

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.. 20

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой химии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов.

 В большинстве отраслей пищевой промышленности, практике научных исследований и особенно в медицине используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование и др.[1]

 

Подавляющее большинство промышленно важных ферментов является белками. Так как основным растворителем белков является вода, то изменяя некоторые ее свойства (температура, ионная сила, рН, добавление нейтральных солей, водорастворимых органических соединений или других инертных соединений) можно создать определенное окружение белковой молекулы, повлиять на ее гидратный или сольватный слой и вызвать агрегацию белковых молекул и выпадение их в осадок. В промышленности в основном используют осаждение солями и органическими растворителями. Эти способы несколько отличаются по механизму осаждения. [2].

 

Примеры осаждения органическими растворителями

При помощи органических растворителей были очищены (и кристаллизованы) многие ферменты. Например, этанол применен для фракционной очистки гексокиназы из дрожжей, пепсин выделен и кристаллизован из водного этанола. С помощью ацетона были получены частично очищенные препараты ферментов из мышечного экстракта, также очищена амилаза слюны. Применение диоксана (фракционирование различными его концентрациями) позволило очистить каталазу бычьей печени, а затем кристаллизовать ее прибавлением сульфата аммония. В растворах этанола различной концентрации удалось из экстрактов поверхностных культур плесневых грибов получить осадки, содержащие почти полностью разделенные фракции амилаз и протеаз.

 

 

ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ РАСТВОРАМИ СОЛЕЙ (ВЫСАЛИВАНИЕ)

Какие соли используются

Для высаливания в основном используются нейтральные соли щелочных металлов. Высаливающий эффект различных ионов зависит от их ионной силы. По силе высаливающего действия анионы натриевых солей можно расположить в следующий ряд:

SO₄ ^2- > CH₃COO^- > Cl^-> NO₃^- > Br^- > I^- > CNS^-

а катионы —

Li ⁺> Na⁺> K⁺ >(NH₄)⁺

При высаливании сложных биохимических смесей соль может взаимодействовать и с другими соединениями, вызывая их осаждение. Поэтому высоленные или осажденные растворителями ферментные препараты содержат до 60-85 % балластных сопутствующих веществ.

Для высаливания могут быть использованы сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат цинка и хлористый натрий. Наиболее часто используют сульфат аммония.

 По очистке и фракционированию с применением сульфата аммония выполнено огромное количеств работ, эта соль чрезвычайно эффективна в качестве осаждающего агента. Она  не только не оказывает денатурирующего действия на ферментные белки, но, наоборот, стабилизирует большинство из низ. Поэтому при ее использовании нет надобности вести фракционирование системы при низкой температуре.

Даже самые чистые препараты сульфата аммония имеют слабокислую реакцию и во всех случаях при использовании его необходим тщательный контроль рН при высаливаниях, вводят сухую соль или пользуются наиболее концентрированными, насыщенными растворами ее.

Обычно считают нецелесообразным повторять фракционирование сульфатом аммония в одинаковых условиях несколько раз подряд. Но если варьировать температуру или рН, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может измениться. В таком случае целесообразно проводить фракционирование последовательно, при разных условиях. Иногда для разделения системы используют различные соли последовательно или в виде смеси. Так, известен метод, в котором обезжиренную муку земляного ореха экстрагировали 10%-ным хлористым натрием при рН = 6,0, а затем из осветленного экстракта белки фракционировали с помощью сульфата аммония.

Однако сульфат аммония при хранении проявляет тенденцию к закислению и даже к выделению аммиака; он очень агрессивен по отношению к металлам и бетону, и возникают большие сложности при нейтрализации и регенерации этой соли в промышленных масштабах.

ОСАЖДЕНИЕ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

Ионы тяжелых металлов также довольно широко применяются для осаждения и фракционировния различных белков, в частности ферментов. Для этих целей могут использоваться соли свинца, ртути, цинка, железа и реже — меди и урана. Кальций и барий также являются специфическими осадителями некоторых белков.

Ионы металлов редко применяют как единственный способ очистки, а чаще в сочетании с другими методами, такими как фракционирование при помощи солей и спиртов. Иногда тяжелые металлы используют для осаждения балластных белков из ферментного препарата; это можно делать только тогда, когда доказано специфическое сродство металла к определенным реакционноспособным группам некоторых типов белковых молекул. Благодаря такой специфичности металлы, подобранные соответствующим образом, можно использовать также для улучшения кристаллизации ферментов из смеси или для их дробного осждения.

Основным недостатком ионов тяжелых металлов является то, что, как и органические растворители, они обладают способностью интенсивно денатурировать белки. Однако тщательное регулирование температуры и рН значительно снижет вероятность необратимой денатурации (инактивирования) ферментов: ртуть, например, которая в высшей степени ядовита для большинства ферментных систем из-за своей способности реагировать с сульфогидрильными группами, может осаждать ферменты (энолазу) практически не денатурируя их, и облегчать кристаллизацию.

Отделить атомы металлов от белков можно различными способами; цинк, например, удаляли диализом белковых растворов против растворов глицина, этилендиамино-тетрауксусной (ЭДТА), лимонной кислоты или снижением рН смеси, или с помощью катиообменных смол.[4]

 

ПРИМЕР ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИХ ДРОЖЖЕЙ

При выделении белков часто сочетают несколько методов осаждения. Выделение дегидрогеназы начинают с экстракции фермента буферным раствором. За этим следует умеренное нагревание для осаждения белков и других компонентов смеси, легче подвергающихся денатурации, чем выделяемая дегидрогеназа. Большую часть фермента (а также другие вещества с близкой растворимостью) осаждают ацетоном; при этом отделяются многие низкомолекулярные соединения, экстрагирующиеся вместе с белком. Последующее растворение и повторное осаждение сульфатом аммония приводят к получению препарата с большей удельной ферментативной активностью. Такой способ очистки, однако, сопровождается потерей некоторого количества фермента на каждой операции (см таблицу 1)

Дальнейшую очистку для отделения дегидрогеназы от других белков с близкой растворимостью выполняют путем последовательного суспендирования осадка во все менее и менее концентрированных растворах сульфата аммония. Поскольку растворимость белков возрастает при снижении концентрации соли до величин, значительно уступающих концентрации насыщенного раствора, то таким путем удается очистить фермент от все более и более близких белков. Полученная в результате ряда таких операций супернатантная жидкость имеет удельную активность (ферментативную активность, отнесенную к общему количеству растворенных белков), которая примерно в 100 раз превышает удельную активность исходного продукта экстракции буферным раствором. Кроме того в этих операциях отделяется большая часть примесей небелковой природы.[3]

 

Таблица 1

Выделение алкогольдегидрогеназы из сухих пекарских дрожжей

	Ферментативная активность единиц
	Общая (x10-4)	Удельная
Первый экстракт После тепловой обработки После осаждения ацетоном После первого осаждения сульфатом аммония	25 30 20 14	4 000 8 000 45 000 70 000
	Белок в растворе
Концентрация (NH4)2SO4 в % от насыщенного раствора	Удельная активность	Всего белков, %
50 45 40 35 25	180 000 200 000 650 000 440 000 430 000	14,9 12,5 12,0 6,6 19,5

 

 

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 3

1.ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ.. 5

1.1. Факторы, влияющие на осаждение ферментов. 6

1.2. Установки для осаждения ферментов. 9

1.3. Примеры осаждения органическими растворителями. 11

2.ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ РАСТВОРАМИ СОЛЕЙ (ВЫСАЛИВАНИЕ) 12

2.1. Описание процесса высаливания. 12

2.2. Факторы, влияющие на процесс. 13

2.3. Какие соли используются. 14

2.4. Проведение процесса высаливания. 15

3.ОСАЖДЕНИЕ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ.. 17

4.ПРИМЕР ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ.. 18

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.. 20

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой химии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов.

 В большинстве отраслей пищевой промышленности, практике научных исследований и особенно в медицине используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование и др.[1]

 

Подавляющее большинство промышленно важных ферментов является белками. Так как основным растворителем белков является вода, то изменяя некоторые ее свойства (температура, ионная сила, рН, добавление нейтральных солей, водорастворимых органических соединений или других инертных соединений) можно создать определенное окружение белковой молекулы, повлиять на ее гидратный или сольватный слой и вызвать агрегацию белковых молекул и выпадение их в осадок. В промышленности в основном используют осаждение солями и органическими растворителями. Эти способы несколько отличаются по механизму осаждения. [2].

 

ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ

Фракционирование и очистка ферментов с помощью органических растворителей – один из основных методов очистки белковых веществ. Органический растворитель, используемый для осаждения должен полностью смешиваться с водой и не связываться с ферментом. Чаще всего используются этанол, изопропанол, ацетон, метанол, диоксан и реже – эфир, диэтилкарбонил, коллидин, некоторые ароматические и гетероциклические амины. При выборе растворителя следует помнить о его возможной токсичности, взрывоопасности и возможности регенерации. С учетом этого наиболее пригодны для производства этанол и изопропанол и меньше — ацетон.

Эффект осаждения белков связан с тем, что в присутствии органического растворителя снижается активность воды. По мере увеличения растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Диэлектрическая постоянная растворителя снижается, происходят вытеснение молекул воды с поверхности белковой молекулы и их частичная иммобилизация молекулой органического растворителя, вследствие гидратации белка. Поэтому молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул.

Агрегирование белков происходит под действием электростатических и Ван-дер-Ваальсовых сил, возникающих между отдельными белковыми молекулами. Гидрофобное взаимодействие имеет меньшее значение в результате влияния органических растворителей на неполярные участки белковой глобулы.