Глава 2. Материалы и методы исследования

В качестве материала исследования использовалось пастеризованное покупное молоко, нормализованное до жирности 3,2 %. Для закваски использовали культуры,  полученные из сметаны и кефира. Выбор заквасок был обусловлен различными микроорганизмами, используемыми для получения данных продуктов. При производстве сметаны используют бактерии, при производстве кефира – грибки. Так же эта информация находилась на упаковках от производителя.

При проведении работы мы руководствовались методическими рекомендациями изложенными в Большом школьном биологическом практикуме (Степанчук, 2019)

На первом этапе работы, мы получили накопительную культуру соответствующих возбудителей молочнокислого брожения. Для этого мы несколько раз проводили пересевы культуры на новые порции молока.

Порции молока подвергали кипячению, затем его остужали естественным способом до 37⁰С и засевали микрофлорой из сметаны и кефира. Посев проводили из произвольного расчета 1 столовая ложка кисломолочного продукта на 100 мл молока. Посев проводили в стерильные стеклянные боксы небольшого объема. После посева, боксы с засеянным субстратом плотно оборачивали фланелью, сложенной в несколько слоев и оставляли в теплом месте на 12 ч. Затем продолжали культивирование при комнатной температуре. С каждым пересевом молоко скисало заметно быстрее. Мы связали это с возрастающим числом микробных клеток в культуре при каждом пересеве.

На втором этапе, мы делали мазки из культуры, окрашивали их по Грамму и изучали в проходящем свете микроскопа. Для окрашивания по Грамму использовали стандартную методику последовательного окрашивания основными и кислыми красителями.

Для этого изготавливали мазок культуры на обезжиренном стекле, фиксировали его над пламенем горелки. Окрашивали генцианвиолеттом 1-2 мин. Затем смывали краситель раствором Люголя. Протравливали мазок спиртом в течение одной минуты. После промывания, окрашивали карболовым фуксином1-2 мин. Затем мазок высушивали и микроскопировали в проходящем свете вначале при малом, затем при большом увеличении.

На третьем этапе выполнения работы, мы определяли интенсивность молочнокислого брожения по количеству образовавшейся молочной кислоты за единицу времени. Количество образовавшейся кислоты определяли методом титрования, предварительно проведя качественную реакцию на молочную кислоту с реактивом Уффельмана.

Для этого в пробирку наливали 3 мл 2 % раствора фенола и добавляли 2-3 капли 1% раствора хлорида железа (III) до появления фиолетовой окраски. В приготовленный реактив добавляли 2 мл культуральной среды и наблюдали изменение окраски на желтовато-зеленоватую.

Проводили и качественную реакцию на этиловый спирт. Для этого к среде добавляли немного  3 % р-ра гидроксида калия и нагревали смесь, не доводя до кипения. Добавляли в смесь несколько кристаллов кристаллического йода и продолжали нагревание. В присутствии спирта должен выпадать желтый осадок йодоформа (СН3J) с характерным запахом.

Титрование проводили 0,1 н раствором гидроксида натрия с фенолфталеином стандартным способом. Для определения молочной кислоты использовали два параметра: начальную кислотность молока и конечную кислотность среды. Кислотность выражали в градусах Тернера. Один градус соответствует количеству щелочи, пошедшей на титрование, умноженной на 10 при определении начальной кислотности молока и, умноженной на 100, при определении конченой кислотности молока. Один градус Тернера количественно эквивалентен 9 мг молочной кислоты.

 

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

Характеристика возбудителей молочнокислого брожения

В опытных образцах

Поскольку мы не проводили специального посева на селективные питательные среды, а проводили выращивание микроорганизмов на молоке, то описать культуральные свойства изучаемых культур довольно сложно. Однако, с учетом цели нашего исследования, тщательное описание культуральных свойств и не требовалось. Нашей задачей в этой части исследования, было формальное установление группы возбудителей молочнокислого брожения. Однако некоторые наблюдения о характере роста микроорганизмов, нам все же удалось сделать.

Так, среда, зараженная микроорганизмами из сметанной закваски скисала дольше по сравнению со средой, зараженной кефирной закваской. Позже образовывался и плотный сгусток с характерным приятным ароматом.

Кефирная же закваска приводила к скисанию молока быстрее, плотный сгусток формировался практически с самого начала скисания.

В среде со сметанной закваской не отмечались пузырьки газа на протяжении трех дней инкубации. Обнаруживается приятный сладковато-кисловатый запах. Вкус приятный, мягкий. Сгусток умеренной плотности.

В среде с кефирной закваской при инкубации в течение суток пузырьков газа не обнаруживается. Однако через двое суток небольшое количество пузырьков газа все же образовывалось в низлежащих слоях среды. Через трое суток инкубации, визуальное количество образовавшихся пузырьков значительно не изменялось. Аромат приятный, кисловатый. Вкус приятный, несколько терпкий и более кислый, нежели у культуры на сметанной закваске.

В мазках культуры, полученной из сметанной закваски, окрашенных по Граму, мы обнаружили в поле зрения множество грамположительных микрококков, местами объединенных в стрептококки небольших цепочек. Материал для окрашивания брали по завершении первых суток инкубации.

В мазках из культуры, полученной на кефирной закваски к концу первых суток инкубации в поле зрения было умеренное количество кокковых форм бактерий, в основном, микрококки. Микроорганизмы проявляли в основном положительную окраску по Граму, но встречались и Грам-отрицательные формы. Через двое суток в мазке обнаруживались округло-овальные клетки с более четко очерченной оболочкой, чем у кокковых форм. Мы предполагаем, что обнаруженные формы относятся к дрожжам. Очевидно, что их жизнедеятельность и придает тот терпковатый усиленно кислый вкус сбраживаемому молоку.

На основании этих наблюдений мы можем прийти к выводу о том, что в сметанной закваске используются различные формы лактобактерий, для которых характерно, в большей мере, гомоферментное брожение. В кефирной же закваске присутствует ассоциативная культура микроорганизмов, состоящая из бактерий и дрожжей. В этом случае происходит гетероферметное брожение, о чем свидетельствует образование пузырьков газа и своеобразный, более пикантный вкус, обусловленный, вероятно, присутствием спирта в среде.