Схема постановки основного опыта РСК

┌──────────┬────────────────────────────────────┬─────┬─────┬─────┬─────┐

│Ингредиен-│ Разведение сывороток │конт-│конт-│конт-│конт-│

│ты │ │роль │роль │роль │роль │

│реакции ├────┬────┬────┬────┬────┬─────┬─────┤сыв. │анти-│ком- │гем. │

│ │1:10│1:20│1:40│1:80│1:60│1:320│1:640│ │гена │плем.│сист.│

├──────────┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┤

│ 1-й этап │

├──────────┬────┬────┬────┬────┬────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┤

│Сыворотка │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│(мл) │ │0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ - │ - │ - │

├──────────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│Антиген │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│(мл) │ │0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │ - │ 0,1 │ - │ - │

├──────────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│Компле- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│мент (мл) │ │0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ - │

├──────────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│Физиологи-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ческий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│(мл) │ │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ 0,1 │ 0,1│ 0,2 │ - │

├──────────┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┤

│ Экспозиция 16 - 20 часов при +4°С │

├───────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│ 2-й этап │

├──────────┬────┬────┬────┬────┬────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┤

│Гемолити- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ческая │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│система │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │0,2 │

│(мл) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├──────────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│Физиологи-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ческий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ 0,4 │

│(мл) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├──────────┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┤

│ Экспозиция 20 - 30 минут при +37°С │

└───────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

На втором этапе в каждую пробирку или лунку добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при +37 С 30 минут. Пробирки или панели тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20 - 30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях. В пробирки с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Оценка главного опыта заключается в степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз. Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся задержкой гемолиза не менее чем на три креста.

Результаты реакции считают достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и рабочей дозе комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует. Диагностический титр может считаться 1:10 при условии нарастания титра в 4 раза (и более) с интервалом в 7 дней.

В РСК оба ингредиента используются в дозе, равной 1 ЕД. Дозы определяют путем перекрестного ("шахматного") титрования.

 

Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека (РА)

 

Реакция агглютинации (РА) является наиболее простым тестом и может быть применена для лабораторной диагностики не только сыпного тифа, но и большинства риккетсиозов. Вместе с тем для ее постановки необходимы дорогостоящие тщательно очищенные корпускулярные риккетсиальные антигены.

Ее преимуществом является минимальное число компонентов реакции (исследуемая сыворотка и антигенный диагностикум) и более раннее выявление агглютининов.

Метод обладает, вместе с тем, существенными недостатками:

1) для исследований пригодны только свежие негемолизированные сыворотки, хранящиеся не более 14 дней;

2) затруднена ретроспективная диагностика, поскольку агглютинины выявляются менее продолжительное время после болезни;

3) в случае использования бесцветного антигена - субъективизм при оценке результатов.

Ингредиенты реакции: 1) исследуемая инактивированная при +56°С в течение 30 минут прозрачная, свежая сыворотка, 2) корпускулярный антиген, 3) физиологический раствор.

РАР выполняется в макро- (0,4 мл; 6 капель - по Мосингу) и микровариантах (0,05 мл) всегда объемным способом, что ведет к разбавлению вдвое начального разведения сыворотки (например, сыворотка, разведенная 1:10 в объеме 3 капель, при добавлении антигена в объеме 3-х капель будет иметь разведение 1:20).

Для макроварианта РА используют бесцветные корпускулярные антигены, которые разводят согласно этикетке на ампуле, и жидкий антиген коричневого цвета, приготовленный из риккетсий Провачека, культивируемых в кишечнике вшей (для РАР может быть использован также сухой люминесцирующий диагностикум из риккетсий для ИФРМА).

 

Постановка РА. Макровариант.

Готовят в агглютинационных пробирках или пластинах последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки с 1:5 в объеме 0,2 мл или 3-х капель. С этой целью вносят во все пробирки, кроме первой, по 0,2 мл физиологического раствора (или по 3 капли). В отдельной пробирке или лунке готовят исходное разведение сыворотки (1:5), т.е. 0,1 мл сыворотки + соответственно 0,4 мл физиологического раствора. Из него 0,2 мл (3 капли) вносят в первую пробирку или лунку, 0,2 мл (3 капли) - во вторую и 0,2 мл (3 капли) - в контрольную. Затем из 2-й пробирки после перемешивания сыворотки и физиологического раствора, 0,2 мл (3 капли) переносят в следующую и так до конечного разведения. Первое разведение сыворотки (1:5) после добавления антигена будет соответствовать 1:10, о чем делается надпись на пробирке или лунке.

После окончания разведения всех сывороток во все разведения сывороток добавляют антиген (за исключением контроля сыворотки) по 0,2 мл (3 капли), встряхивают штативы с пробирками или панели (продувая воздух в пластины из пипетки) и отставляют на 16 - 18 часов при +37°С (пластины покрывают стеклом во избежание подсыхания ингредиентов).

Постановка РА предусматривает контроль каждой исследуемой сыворотки: 0,2 мл (3 капли) начального ее разведения +0,2 мл (3 капли) растворителя; контроль антигена: 0,2 мл (3 капли) антигена + 0,2 мл (3 капли) растворителя, а также ставят контроль стандартной специфической сыворотки с известным титром антител. Последнюю разводят на одно разведение выше указанного на этикетке титра (табл.7).

 

Таблица 7