Навигация:

Главная Случайная страница Обратная связь ТОП Интересно знать Избранные Новые материалы

Топ:

Установка замедленного коксования: Чем выше температура и ниже давление, тем место разрыва углеродной цепи всё больше смещается к её концу и значительно возрастает...

Основы обеспечения единства измерений: Обеспечение единства измерений - деятельность метрологических служб, направленная на достижение...

Процедура выполнения команд. Рабочий цикл процессора: Функционирование процессора в основном состоит из повторяющихся рабочих циклов, каждый из которых соответствует...

Интересное:

Финансовый рынок и его значение в управлении денежными потоками на современном этапе: любому предприятию для расширения производства и увеличения прибыли нужны...

Берегоукрепление оползневых склонов: На прибрежных склонах основной причиной развития оползневых процессов является подмыв водами рек естественных склонов...

Инженерная защита территорий, зданий и сооружений от опасных геологических процессов: Изучение оползневых явлений, оценка устойчивости склонов и проектирование противооползневых сооружений — актуальнейшие задачи, стоящие перед отечественными...

Дисциплины:

Автоматизация Антропология Археология Архитектура Аудит Биология Бухгалтерия Военная наука Генетика География Геология Демография Журналистика Зоология Иностранные языки Информатика Искусство История Кинематография Компьютеризация Кораблестроение Кулинария Культура Лексикология Лингвистика Литература Логика Маркетинг Математика Машиностроение Медицина Менеджмент Металлургия Метрология Механика Музыкология Науковедение Образование Охрана Труда Педагогика Политология Правоотношение Предпринимательство Приборостроение Программирование Производство Промышленность Психология Радиосвязь Религия Риторика Социология Спорт Стандартизация Статистика Строительство Теология Технологии Торговля Транспорт Фармакология Физика Физиология Философия Финансы Химия Хозяйство Черчение Экология Экономика Электроника Энергетика Юриспруденция

Схема титрования гемолитической сыворотки

2017-05-23

599

0.00 из 5.00 0 оценок

Заказать работу

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 10Следующая ⇒

┌────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │

│ опыта │ │

│ ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤

│ │ 1:1000 │ 1:1200 │ 1:1600 │ 1:1800 │ 1:2000 │

├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │

│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │

│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │

│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ Физ. │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │

│ Оценка │ │ │ │ │ │

│ результатов │ │ │ │ │ │

│ опыта │ - │ - │ - │ - │ ++ │

└────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘

│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │

│ опыта ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤

│ │ 1:2400 │ 1:2800 │ 1:3000 │ 1:3200 │ 1:3600 │

│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │

│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │

│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │

│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │

│ Физ. │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │

│ Оценка │ │ │ │ │ │

│ результатов │ │ │ │ │ │

│ опыта │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │

Титр гемолитической сыворотки 1:1800.

Для получения эритроцитов барана, кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10 - 15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4°С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов или каком-либо другом консерванте.

1-я схема постановки РСК.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Тирование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).

Таблица 2

┌──────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│Ингредиенты │ Дозы комплемента │

│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ разведении │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ 1:10 (мл) │ 0,1 │ 0,2│ 0,3 │ 0,4│ 0,5│ 0,6│ 0,7│ 0,8 │ 0,9 │

│Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ческий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор (мл) │ 0,9 │ 0,8│ 0,7 │ 0,6│ 0,5│ 0,4│ 0,3│ 0,2 │ 0,1 │

└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘

Затем ставят опыт титрования комплемента.

Таблица 3

│ Ингредиенты │ Дозы комплемента │

│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ различных │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│дозах (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

│Антиген (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

│Физиологичес- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│кий раствор │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │

│Гемолитическая│ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ 0,2 │

│Оценка резуль-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ татов │ 4+ │ 3+ │ 2+ │ + │ - │ - │ - │ - │ - │

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37°С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут), и через 30 минут производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).

Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +3°С в течение 1 часа.

Постановка основного опыта.

1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 061 м; антигена и комплемента в рабочих дозах.

К каждому опыту ставят следующие контроли:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении +0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора. 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);

5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;

6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют 2???? разведениях (1:10 - 1:40), включая так же как и для п. 5 контроля сывороток в исходных разведениях.

После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при + 37°С на 1 час.

2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20 - 30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.

2-я схема постановки РКС (по Fiset).

Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4°С 16 - 18 часов не в день постановки реакции, 1 - 2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше - 20 С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).

Титрование комплемента.

Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента, содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).

Таблица 4

┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиенты │ Разведения комплемента │

│ ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┬────────┤

│ │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │

├─────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤

│ Комплемент │ │ │ │ │ │ │

│ 1:10 (мл) │ 1 │ 1 │ 0,5 │ 0,5 │ 0,5 │ │

│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │

│ ческий │ │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,5 │ 0,8 │ 0,5 │ 0,75 │ 1,0 │ │

└─────────────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┘

Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).

Таблица 5

│ Ингредиенты │ Разведение комплемента │

├─────────────────┴─────────────────────────────────────────────────────┤

│ Контрольный ряд │

│ (оценка качества комплемента) │

├─────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬────────┬────────┤

│ │ 1:10 │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │

├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤

│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │

│различных │ │ │ │ │ │ │ │

│разведениях (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ │

│Физиологический │ │ │ │ │ │ │ │

│раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │

│Гемолитическая │ │ │ │ │ │ │ │

│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │

│Оценка резуль- │ │ │ │ │ │ │ │

│тата │ - │ - │ - │ - │ - │ + │ │

├─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┤

│ Опытный ряд │

│ (оценка антикомплементарных свойств антигена) │

│ Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │

│ различных │ │ │ │ │ │ │ │

│ разведениях │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

│ Антиген в │ │ │ │ │ │ │ │

│ рабочей дозе │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │

│ ческий │ │ │ │ │ │ │ │

│ раствор (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │

│ Гемолитичес- │ │ │ │ │ │ │ │

│ кая система* │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ │

│ Оценка │ │ │ │ │ │ │ │

│ результатов │ - │ - │ - │ - │ + │ +++ │ │

└─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┘

* Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16 - 18 часов экспозиции при температуре +4°С).

Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.

После 30-минутной экспозиции при температуре +37°С учитывают результаты.

При постановке реакции "холодным" методом (+0°С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге, рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 ил, поскольку, в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок неодолимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.

В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.

При постановке реакции при +37°С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т. е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.

В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при + 37°С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе +0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе +0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе +0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37°) для контроля используют 2 последние дозы.

Постановка основного опыта.

Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистироловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

3) контроль комплемента (как указано выше);

4) контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при +0°С на 16 - 20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).

Таблица 6

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒

Поделиться с друзьями:

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...

Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...

История развития хранилищ для нефти: Первые склады нефти появились в XVII веке. Они представляли собой землянные ямы-амбара глубиной 4…5 м...

Адаптации растений и животных к жизни в горах: Большое значение для жизни организмов в горах имеют степень расчленения, крутизна и экспозиционные различия склонов...