Цитохимическое исследование миелопероксидазы

 

Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляется высокая активность миелопероксидазы в виде гранул, заполняющих цитоплазму.

 

Самая высокая активность фермента наблюдается в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительная реакция на миелопероксидазу наблюдается в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах и мегакариоцитах миелопероксидаза не определяется.

 

В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций.

 

Метод Грэхема-Кнолля

 

Принцип метода: В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.

 

Посуда

* Химические стаканы.

* Мерные цилиндры.

* Пипетки.

 

Реактивы:

* 4% формалиново-спиртовой раствор (10 частей 40% формалина и 90 частей 96% спирта).

* Пероксидазный реактив: бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл 96% спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл 3% перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5 — 6 дней.

* Краситель Романовского-Гимзы.

 

Ход окраски:

 

* Свежие мазки (1-2-дневной давности) фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.

* Обмывают в проточной воде и высушивают.

* Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.

* Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.

* Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.

* Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.

 

Модифицированный метод Нарциссова Р. П.

 

Принцип:

В присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Для уменьшения инактивации фермента использованы соответствующий фиксатор и небольшое количество перекиси водорода.

 

Реактивы

* 60% водный раствор ацетона.

* 0,1 M раствор бората натрия (можно использовать фосфатный или мединаловый буферный раствор pH 7,6).

* Инкубационная среда: 5 мл 5% водного раствора трилона Б, 10 мл раствора бората натрия, 35 мл насыщенного раствора бензидина и 2 мл 0,003% раствора перекиси водорода (готовят из 3% раствора разведением в два этапа перед употреблением).

* 0,5% раствор метилового зеленого на буферном растворе (pH 5,0) или 0,1% водный раствор метиленового синего.

 

Ход окраски

* Свежеприготовленные мазки фиксируют в 60% водном растворе ацетона в течение 30 секунд.

* Промывают дистиллированной водой.

* Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 часа в термостате при 37 °C.

* Промывают дистиллированной водой.

* Докрашивают мазки метиловым зеленым или метиленовым синим в течение 10 минут.

 

Модифицированный метод Шафран М. Г. и соавторов

 

Принцип:

окисление О-дианизидина перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы.

 

Реактивы

* 10% спиртовой раствор формалина (1 мл 10% формалина и 9 мл этилового спирта).

* Спиртовой раствор О-дианизидина:

24 мг О-дианизидина растворяют в 5 мл метанола и доводят дистиллированной водой до 9,9 мл.

* 3% раствор перекиси водорода.

* Реакционная смесь: к спиртовому раствору О-дианизидина прибавляют перед употреблением 0,1 мл перекиси водорода.

* 0,25% водный раствор азура А или другой ядерный краситель.

 

Ход окраски

* Мазки фиксируют спиртовым раствором формалина в течение 10 - 15 секунд.

* Споласкивают проточной водой.

* На мазки наносят реакционную смесь на 2 — 3 мин при комнатной температуре.

* Споласкивают проточной водой.

* Докрашивают раствором азура в течение 10 — 15 секунд.

* Споласкивают проточной водой и высушивают.